Aminoacyl-tRNA synthetases נמצאים הן eukaryotes וחיידקים. אף על פי שלאיקריוטים יש 20 סינתזות אמינואציל-tRNA שונות כדי להתאים ל-20 חומצות אמינו, לחיידקים רבים אין גנים לכל הסינתזות האלה של אמינואציל-tRNA. למרות זאת, הם עדיין משתמשים בכל 20 חומצות האמינו כדי לסנתז את החלבונים שלהם. לדוגמה, לחלק מהחיידקים אין את הגן המקודד את האנזים שמקשר גלוטמין עם tRNA בן זוגו. באורגניזמים אלה, אנזים אחד מוסיף חומצה גלוטמית לכל מולקולות tRNA של חומצה גלוטמית, כמו גם לכל מולקולות tRNA של גלוטמין. לאחר מכן, אנזים שני משנה כימית את החומצה הגלוטמית לגלוטמין על מולקולות ה-tRNA האחרונות, ובכך יוצר את הזוג הנכון.

החשיבות השווה של tRNA ו-aminoacyl-tRNA synthetase נקבעה על ידי סדרת ניסויים שבהם חומצת אמינו אחת הומרה כימית לחומצת אמינו אחרת לאחר שחוברה ל-tRNA הזוגי שלה. בניסוי סינתזת חלבונים במבחנה, מולקולות אמינואציל-tRNA "היברידיות" אלה החדירו את חומצת האמינו השגויה בכל נקודה בשרשרת הפפטידים, שבה נעשה שימוש ב-tRNA זה. התוצאות הראו כי הן ה-tRNA והן האנזים נדרשים במידה שווה לתרגום תקין של רצף חומצות האמינו המקודד על ידי ה-mRNA.

בתאים, סינתזות aminoacyl-tRNA משתמשות בהשלמה מבנית וכימית כדי לזהות את ה-tRNA הנכון שיש להצמיד לחומצת האמינו הקשורה באתר הפעיל שלה. רוב הסינתזות tRNA מכילות שלושה כיסים סמוכים קושרי נוקלאוטידים, שכל אחד מהם משלים בצורתו ובמטען שלו לנוקלאוטיד באנטיקודון. בעוד כיסים אלה מזהים את הנוקלאוטידים הספציפיים בלולאת האנטיקודון של ה-tRNA, חומצות אמינו נוספות מתקשרות עם הזרוע המקבלת חומצות אמינו, ובכך מאפשרות ל-tRNA הנכון להתאים לאתר הסינתזה של האנזים.