Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

Resumen

Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Resumen

Una de las ventajas del pez cebra el estudio es la facilidad y la velocidad de la manipulación de los niveles de proteína en el embrión. Morfolinos, que son oligonucleótidos sintéticos con la complementariedad de los ARN antisentido objetivo, se puede agregar a los embriones para reducir la expresión de un producto genético particular. Por el contrario, el ARNm procesado se puede agregar a los embriones para aumentar los niveles de un producto genético. El vehículo para incorporar el uso de ARNm o morfolino a un embrión es la microinyección. Microinyección es eficiente y rápida, lo que permite la inyección de cientos de embriones por hora. Este video muestra todos los pasos necesarios para la microinyección. En pocas palabras, los huevos son recogidos inmediatamente después de ser despedido y se alinearon en contra de un portaobjetos de microscopio en una placa de Petri. A continuación, una aguja de punta fina cargados con material de inyección está conectado a un microinyector y una fuente de aire, y los controles microinyector se ajustan para producir un volumen de inyección deseable. Finalmente, la aguja se hundió en la yema del embrión y el morfolino o ARNm es expulsado.

Protocolo

Parte 1: La producción de huevos y la recolección

1. La noche antes de la inyección, coloque el pescado en la cría de los tanques con divisiones en su lugar. Para aumentar la producción total de huevos, el pescado se puede configurar en una proporción de dos mujeres a un hombre si así lo desea.
2. A la mañana siguiente, después de la luces de la habitación a su vez, tire los divisores de varios tanques y permitir que durante unos 20 minutos de tiempo de apareamiento sin ser molestados.
3. Utilizando un colador, recoger los huevos de las jaulas de cría y enjuague con agua de huevo. Vierta los huevos en un plato Petri con agua de huevo y remover los óvulos no fertilizados y los escombros con una pipeta de transferencia. Los peces pueden ser reagrupados en grandes tanques para producir nuevas rondas de huevos para la inyección. Ajustar el tiempo de la recolección de huevos para permitir el máximo número de huevos que se producen, sin dejar pasar la etapa unicelular.
4. Colocar un portaobjetos en la tapa invertida de una placa de Petri de 100 mm. Use una pipeta de transferencia a la línea de los huevos contra el lado de la diapositiva que forman una sola columna. Eliminar el agua sobrante del huevo de diapositivas pulsando un Kimwipe contra el lado opuesto de los huevos. (Figura 1)

Parte 2: la aguja de tracción, de carga, y la preparación

1. Con un extractor de micropipeta, tirar de un vidrio de 1,0 mm OD capilar en dos agujas y guárdelo en un plato de Petri de 150 mm mediante la fijación sobre las rampas de plastilina. Las agujas se puede tirar de antemano.
2. Retrocarga la aguja con 3 l de material de inyección con una pipeta microloader. Agite bien el bolo hacia la punta de la aguja hasta que no haya burbujas de pocos o ningún resto.
3. Encienda la fuente de aire y microinyector. Insertar la aguja en el microinyector y asegurar un sello hermético en la vivienda. Compruebe que el micromanipulador se encuentra en una posición adecuada para permitir una amplia gama de movimiento y ajuste. Llevar la punta de la aguja en el plano de visión del microscopio de alta del escenario, y se centran en el más delgado de la región de la punta. Use un par de pinzas para apretar fuerte de la aguja en un punto que deja la aguja lo suficientemente estrecha como para perforar el corion y la yema, pero todavía capaz de ofrecer un tamaño de grano uniforme. Una gota de aceite mineral en un micrómetro puede utilizarse para calcular el volumen de cada inyección. Cuando se inyecta en el aceite, un cordón con un diámetro de 0,1 mm contiene 500 pL de material de inyección (figura 1B), los volúmenes de inyección de 500 pL o 1NL se utilizan normalmente. Pise el pedal y controlar el tamaño del grano, mientras que el recorte de la aguja y el ajuste de la presión de inyección, según sea necesario. Ideal volúmenes de inyección llenará aproximadamente el 10% del volumen del huevo. La calidad de la punta de la aguja es crucial tanto para la facilidad de la inyección y la calidad y la consistencia de los resultados.

Parte 3: Inyección

1. Asegúrese de que los embriones no se han desarrollado más allá de la etapa de cuatro células. Idealmente, los embriones debe estar en el estadio de una célula.
2. Baje la aguja hacia la columna de los huevos, la celebración de la antena en su lugar con la mano opuesta.
3. Perforar la superficie del corion y entrar en la yema de un solo golpe suave, mientras que la observación de cualquier aplastamiento o rotura de la vesícula vitelina. Inyectar el material de inyección en la yema (figura 1C). Evitar la inyección de burbujas de aire o estiramiento de la yema, como puede ser letal para el embrión. Trabajando en la línea, ajustar la presión según sea necesario para mantener un tamaño uniforme de cuentas y, con una punta de la pipeta, retirar los huevos no fertilizados que se ven o se destruyen durante el proceso de inyección.
4. Después de completar una columna de huevos, use un chorro suave de agua de huevos para mover los huevos se inyecta en una placa de Petri limpia. Repita según sea necesario. Mantener varios embriones inyectados como un control. Al final del día, eliminar embriones muertos y registrar el número de embriones inyectados. Cambie el agua de huevo en el plato de forma periódica para reducir el riesgo de infección.

Parte 4: Los resultados representativos

Dependiendo de lo que se está inyectando, los embriones pueden sobrevivir a un ritmo menor que sus hermanos no inyectadas. Afortunadamente, es fácil de inyectar un gran número de ellos, así que esto es raramente un problema. Es normal que morphants para exponer el desarrollo de un ligero retraso.

Para ilustrar los resultados de la microinyección, hemos utilizado este protocolo para manipular los niveles de la proteína del Corazón de cristal (HEG). HEG es una proteína transmembrana necesaria para el desarrollo normal del corazón. En su ausencia, se desarrollan los embriones corazones con tractos de entrada gigantes y cámaras de ^1. Hemos inyectado dos morfolinos no descrita con anterioridad en contra de HEG, heg_e3i3_egfr1 y heg_e4i4_egfr2, a una concentración de 500 mM. A los 2 días después de la fecundación, los controles no inyectados hermano parece normal, como se esperaba (Figura 2A y B). Embriones inyectados con heg_e3i3_egfr1 tiene edema cerebral (figura 2C). Aunque los corazones de la mayoría de estos morphants han alterado la morfología, las cámaras son de tamaño normal (Figura 2). Embriones inyectadosheg_e4i4_egfr2 con defectos cardíacos presentan variables. Algunos parecen normales, mientras que otros tienen grandes extensiones de entrada y atrios moderadamente grande (Figura 2 E y F). El mutante HEG, como se informó anteriormente ^1, tiene un tracto de entrada enormemente ampliada y la aurícula (Figura 2 G y H).

También inyecta embriones de tipo salvaje con 400 ARNm ng / l transcribe a partir de larga duración HEG cDNA. Mientras que los controles no inyectados se desarrollan normalmente (figura 3 A y B), los embriones inyectados con ARNm HEG muestran un espectro de fenotipos que van desde la apariencia de tipo salvaje de ciclopía severa, acortamiento del eje del cuerpo principal, la necrosis de la cabeza y el cuerpo, y los defectos de la línea media (figura 3C y D).

Los embriones Figura 1. Que se inyecta se alinean en contra de un portaobjetos de microscopio en una placa de Petri (A). El volumen de inyección se determina mediante la inyección en aceite mineral colocado en un micrómetro. Un volumen de inyección de 500 pL, que se usa comúnmente, tiene un diámetro de 0,1 mm (B). Inmediatamente después de la inyección, el morfolino o ARNm es visible como un punto de puntuar en la yema (C).

Figura 2. A los 2 días después de la fecundación, los embriones inyectados no tienen defectos graves (A) o fenotipo cardíaco (B). Embriones inyectados con la heg_e3i3_egfr1 morfolino tiene edema cerebral (C, flecha), pero las cámaras del corazón de tamaño normal (D). Algunos embriones inyectados con la heg_e4i4_egfr2 morfolino tienen tractos ampliada de entrada y atrios (E, F). HEG mutantes tienen tractos de entrada graves ampliada y en los atrios (G, H). (A), (C), (E) y (G) son 4x imágenes DIC; (B), (D), (F) y (H) es de 20x imágenes DIC. un atrio =, que = tracto de entrada.

Figura 3. A las 24 horas posteriores a la fecundación, los embriones inyectados tienen un cuerpo largo y recto sin defectos necrosis o la línea media (A) y dos ojos claramente definidos, con un tubo neural entre ellos (B). Algunos embriones inyectados con ARNm HEG, en cambio, presentan un eje corporal reducido, necrosis, somitas deformado (C) y ciclopía (D). (A) y (C) son 4x imágenes DIC; (B) y (D) es de 20x imágenes DIC.

Discusión

Una de las fortalezas del sistema de modelo de pez cebra es la facilidad con que los productos de genes específicos puede ser añadido o eliminado del embrión mediante microinyección. Para doquier sobreexpresan una proteína en particular, el mRNA se inyecta en la yema de huevo en la etapa 1 de las células. Durante el desarrollo posterior del embrión, el ARN se distribuye por todo el organismo y traducido. Por el contrario, para eliminar una proteína en particular, morfolinos se utilizan. Morfolinos son oligonucleótidos sintéticos diseñados con la complementariedad de los ARN antisentido específicos. Al igual que los ARNm, morfolinos son inyectados en la yema de huevo en la etapa 1 de las células. Dentro del embrión, que se unen a sus ARNs dianas, la prevención de la traducción.

La principal modificación que debe hacerse para cada morfolino o ARNm es la concentración de material inyectado. Una concentración demasiado alta de cualquiera de morfolino o ARNm no puede causar la toxicidad específica, mientras que cada morfolino debe ser probado empíricamente para determinar su concentración óptima, generalmente entre las concentraciones de morfolino 200 M y M 500 derribar actividad de los genes con eficacia sin causar defectos no específicos. El tamaño exacto de la abertura de la aguja no es crucial. Dentro de un rango de tamaños de aguja, la presión de inyección y el tiempo de inyección se puede ajustar para producir un bolo del volumen correcto.

Morfolinos tienen muchas aplicaciones, incluyendo la disección funcional de los dominios de una proteína. Cuando estén diseñados para destinatarios específicos exón-intrón cruces, morfolinos evitará el empalme que se produzcan allí. Hemos examinado los efectos de dos morfolinos que se unen los exones e intrones cruces en el pre-ARNm de HEG. El heg_e3i3_egfr1 morfolino une la unión entre el exón 3 y el intrón 3, la prevención de la maquinaria de empalme de la incorporación de exón 3 en transcripciones de madurez. El heg_e4i4_egfr2 morfolino similar elimina el exón 4. Tanto los exones 3 y 4 de codificar los dominios que contienen EGF-como repite. Algunos embriones inyectados con heg_e4i4_egfr2 moderadamente fenocopia el mutante más experimentos serán necesarios para comprender el papel de HEG exón 4 en el desarrollo del corazón. Sorprendentemente, los embriones inyectados con heg_e3i3_egfr1 tiene edema cerebral, una característica que no se ve en los mutantes HEG. Esto puede ser debido a la capacidad de morfolinos para obligar a la madre que las transcripciones no se verían afectadas en los mutantes cigóticos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI 100
Micromanipulator	Tool	Narishige International	MN 153
Needle Puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P 97
Glass Capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100 F6
Microloader Pipettes	Tool	Eppendorf	5242956.003
Needle Holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH310