Cerca de la medición de la membrana plasmática y Global Dynamics calcio intracelular en los astrocitos

Resumen

Se describe la forma de medir cerca de la membrana y la dinámica global de calcio intracelular en los astrocitos cultivados usando la reflexión total interna y microscopía de epifluorescencia.

Resumen

El cerebro contiene células gliales. Los astrocitos, un tipo de célula glial, han sabido de largo para proporcionar una función de apoyo pasivo a las neuronas. Sin embargo, la evidencia creciente sugiere que los astrocitos pueden también participar activamente en la función cerebral a través de interacciones funcionales con las neuronas. Sin embargo, muchos aspectos fundamentales de la biología de los astrocitos siguen siendo controvertidas, poco claras y / o explorar experimentalmente. Una cuestión importante es la dinámica de los transitorios de calcio intracelular en los astrocitos. Esto es importante porque el calcio se ha consolidado como un importante segundo mensajero y como se ha propuesto que las elevaciones de los astrocitos de calcio puede desencadenar la liberación de los transmisores de los astrocitos. Sin embargo, no ha habido ninguna descripción detallada o la satisfacción de calcio cerca de la membrana plasmática de señalización en los astrocitos. Total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía es una herramienta poderosa para analizar los eventos de señalización fisiológicamente relevantes dentro de unos 100 nm de la membrana plasmática de las células vivas. En este sentido, el uso de microscopía TIRF y describir la manera de supervisar cerca de la membrana plasmática y la dinámica global de calcio intracelular casi al mismo tiempo. El perfeccionamiento y la aplicación sistemática de este enfoque tiene el potencial de dar a conocer los detalles precisos de la señalización del calcio astrocitos. Una comprensión detallada de la dinámica del calcio astrocitos puede proveer una base para entender si, cómo, cuándo y por qué someterse a los astrocitos y neuronas dependientes de calcio interacciones funcionales.

Protocolo

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

El procedimiento experimental consta de dos partes principales que se describen de una manera paso a paso a continuación.

Parte 1: preparación de los cultivos de astrocitos del hipocampo

En pocas palabras, mezcla de neuronas del hipocampo astrocitos culturas fueron preparados utilizando un protocolo bien establecido ^1,2,3. Hemos optimizado el procedimiento para obtener saludable astrocitos cultivados. Todos los procedimientos que se enumeran a continuación deben ser llevadas a cabo en un ambiente estéril, como una campana de flujo laminar.

Cubreobjetos de la preparación

• Cubreobjetos de 22 mm (VWR, 48380-068)
• Poli-D-lisina (PDL, Sigma P0899), alícuotas (1 mg / ml)
• Laminina alícuotas (20 ug / ml): agregar 49 ml de agua estéril a 1 mg / ml de solución de laminina (Sigma L2020), en versión 1.2 ml alícuotas y guardar a -20 ° C

1. Disolver PDL en agua estéril (50 mg / ml)
2. Autoclave de los cubreobjetos, enjuague con agua estéril y colocar en PDL (20 ml por 100 cubreobjetos). Dejar a temperatura ambiente durante la noche.
3. Vuelva a colocar PDL con agua estéril (3 lavados rápidos). Luego secar los cubreobjetos y se almacenan a 4 ° C.
4. El día de las placas, los astrocitos, cubreobjetos lugar individual en un pozo estéril en una placa de 6 pocillos (Multiwell placas de fondo plano con tapa, estériles de BD Bioscience). Ponga 400 l de laminina en cada cubreobjetos y se incuba durante la noche, en la incubadora para evitar la evaporación.

Disección

Medios de disección:

• 500 ml de Earle solución salina balanceada (EBSS) (1X), líquido (Invitrogen, 14.155-063)
• 5 ml solución HEPES (Sigma, H0887)

Los medios de comunicación del hipocampo:

• 412,5 ml de medio mínimo esencial (MEM) (1X), el líquido contiene sales de Earle, pero no rojo L-glutamina o fenol (Invitrogen, 51200-038)
• 10 ml de glucosa (Sigma, D-(+)-glucosa anhidra SIGMA ULTRA G7528) 1 M en el MEM
• 5 ml penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122)
• 5 ml de sodio piruvato solución (Sigma, S8636)
• 12,5 ml de HEPES solución 1 M (Sigma, H0887)
• 5 ml N-2 Suplemento (100X), líquido (Invitrogen, 17502-048)
• 50 ml de suero de caballo, inactivado por calor (Invitrogen, 26050-088)

La papaína solución:

• Añadir 5 ml de los medios de disección en Worthington papaína-022 vial (LK003178, la concentración final, 20 U / ml) y se incuba a 37 ° C durante 60 min.

1. Decapitar a las crías de rata entre P1 (normalmente 2 cachorros) siguiendo las directrices revisadas y aprobadas por los reglamentos nacionales y locales de su cuidado animal institucional y el empleo.
2. Quite la piel y el cráneo y el cerebro en lugar de una placa de Petri llena de medios de disección en frío.
3. Eliminado meninges, diseccionar los dos hemisferios y diseccionar hipocampo.
4. Picar el hipocampo en ~ 1X1 piezas mm y digerir en solución de papaína a 37 ° C durante 11-13 min.
5. Una vez que las piezas de tejido se han instalado, retire con cuidado la papaína y añadir 5 ml de medio de hipocampo para eliminar todo rastro de la enzima. Repita este paso y se resuspenden en medio del hipocampo (2 ml).
6. Triturar las células unas 5 veces hasta que no queden grumos izquierda, con tres pulido llama pipetas de agujeros cada vez más pequeños (1000 m, ~ 500 ~ 300 micras y micras).
7. Una vez triturado, pasar a las células a través de un colador de células (tamaño de poro, 70 m, BD Bioscience). Contar las células en 10 l de suspensión. Ajustar el volumen del hipocampo de medio a fin de tener 400.000 células / ml.
8. Aspirar la laminina de la cubreobjetos, y antes de que las tapas se pueden secar, la placa de 200 l de la suspensión de células por cubreobjetos.
9. Agregar a conectar durante 60 minutos en la incubadora, y luego agregar 2 ml de medio por pozo del hipocampo.
10. Al día siguiente, aspirado medio del hipocampo de edad para eliminar las células muertas y los desechos y añadir 2 ml de pre-calentado medio del hipocampo fresco.

Mantenimiento

Los medios de comunicación Neurobasal:

• 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
• 10 ml de suero libre B27 suplemento (Invitrogen, 17504-044)
• 5 ml penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122)
• 1,25 ml de L-glutamina (Invitrogen, 25030-149)

Alimentar a los cultivos de neuronas astrocitos dos veces por semana con el medio neurobasal, comenzando cuatro días después de la siembra. Preincubación de los medios de comunicación alrededor de 30 minutos en la incubadora en un frasco de ventilación para equilibrar la temperatura y el CO _2.

Parte 2: imágenes de calcio

Búfer de grabación del hipocampo: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM CaCl _2, 0,8 mM _MgCl2, 10 mM D-glucosa, 10 mM HEPES (Todos los productos químicos de Sigma) pH 7,4 (ajustado con NaOH).

Carga de tintes de calcio indicador en los astrocitos

1. Lugar de la cultura en un pozo en una placa de 6 pocillos lleno con 2 ml de tampón de la grabación del hipocampo que contiene 2,5 M Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) y el 0,05% Pluronic ® solución F-127 del 20% en DMSO (Invitrogen, P-3000MP) e incubar a temperatura ambiente durante 10-30 min.
2. Quitar Fluo-4 solución y lave cubreobjetos 3 veces con tampón de grabación del hipocampo e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
3. Coloque el cubreobjetos sobre la cámara, y limpiar el otro lado del cubreobjetos con líquido de limpieza de lentes.
4. Ponga una pequeña gota de aceite de inmersión (aceite de inmersión DF TIPO de Cargille) sobre el objetivo y poner la cámara (cámara abierta de 25 mm cubreobjetos ronda de Warner Instruments) en la platina del microscopio (Olympus IX71).
5. Observar las células con transmisión de la luz para ver cómo se ven las células, y ponerlos en el foco. Luego iluminar las células con 488 nm de un monocromador (V policromada de TILL Vision) y determinar si la señal de fluorescencia de Fluo-4 es uniforme y detectable en los astrocitos.
6. El uso del PAI y la iluminación TIRF para medir el calcio en los astrocitos.

Microscopía TIRF

En pocas palabras, se utiliza un microscopio Olympus IX71 equipado con una cámara de Andor IXON DV887DCS EMCCD. El control de la excitación y la adquisición de imágenes se realiza mediante software TILLVision. Las vigas de 454/488/515 nm argón (100 mW) y 442 nm de estado sólido (45 mW) láser se combinan y se controla con un láser HASTA Polilínea combinador, condensador TIRF de doble puerto y un filtro sintonizable acoustoptical y el controlador (AOTF, todos de TILL Photonics) y se introduce en una fibra de banda ancha Kineflex para la entrada en el condensador TIRF. Utilizamos un lente Olympus 60X 1,45 NA para lograr TIRF. La ganancia de la cámara se ajusta para cada astrocito para ofrecer la mejor relación señal-ruido de las imágenes. El fondo y los principios de la microscopía TIRF se han revisado recientemente ^{4, 5.} La mayoría de los componentes ópticos que utilizamos fueron adquiridos de TILL Photonics, que ahora es parte de Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). La profundidad de penetración TIR se puede calcular a partir de las siguientes ecuaciones.

d = profundidad de penetración

n1 = índice de refracción del vidrio

n2 = índice de refracción de las células

a = ángulo de incidencia

NAi = apertura numérica de la incidencia

A fin de asegurar que el láser se alinea de manera óptima para TIRF creemos que es útil para observar 100 nm fluorescente talón (Invitrogen, F8803). Se presentan imágenes fijas y videos de cuentas con EPI y microscopía TIRF. Cuando en el TIRF, se observa un aumento dramático en relación señal-ruido y las cuentas de visualización difusión browniana. Creemos que es útil para observar el comportamiento de 100 nm cuentas con microscopía TIRF sobre una base regular (una vez por semana) para asegurarse de que TIRF óptimo se produce, en lugar de la iluminación oblicua en peligro que se produciría si el ángulo crítico no eran iguales a α (ver Fig. 1).

La aplicación de agonistas de la proteína G-receptores acoplados

Los astrocitos expresan una variedad de receptores acoplados a Gq ^{6, 7,} incluyendo los receptores metabotrópicos de glutamato y los receptores P2Y (agonista, ATP, ADP). La activación de estos receptores conduce a un aumento significativo en los niveles de calcio intracelular en los astrocitos. Por ejemplo, uno puede fácilmente observar elevaciones de calcio intracelular durante la aplicación de la ATP (30 mM) a ^8.10 astrocitos. Utilizamos una solución rápida conmutación de Warner Instrumentos llamado VC-77SP rápido paso del sistema de perfusión (http://www.warneronline.com/index.cfm). Con esta solución se puede aplicar el método en menos de ~ 10 ms.

Dibujos Figura 1. Y fotografías de la imagen creada. A. Muestra una fotografía de un microscopio montado en un airtable, mientras que (B) muestra una fotografía de la asamblea de láser, los controladores y las cajas de la viga. C. Muestra una fotografía de la platina del microscopio con la cámara montada para la imagen. A la izquierda del dispositivo de perfusión rápida se puede ver (junto con el motor paso a paso y el tubo de teta). A la derecha de la headstage de un amplificador Axopatch 200A se ve. La caricatura esquematiza la trayectoria de la luz en la puesta en marcha y la forma en TIRF se logra. El láser se centra en el plano focal posterior de la lente del objetivo 60X 1,45 NA y su posición se ajusta fuera del centro por lo que surge en el aceite de inmersión en el ángulo crítico α. En este punto, el rayo sufre de reflexión interna total y se desintegra con una distancia λ (véase la ecuación en el texto principal) en el medio de índice de refracción menor. En este caso, este es el búfer de grabación alrededor de los astrocitos y los propios astrocitos. El resultado es una excitación óptica (y por lo tanto de imagen) de las moléculas dentro de ~ 100 nm de la membrana plasmática. En el dibujo de la célula de esto se muestra en verde los receptores "emocionado" de la membrana, mientras que dentro de la celda o en la superficie superior de la celda, no muy contentos. Un informe completo de la microscopía TIRF ha sido proporcionada por Steyer y Almers ^4.

Figura 2. Imágenes de 100 nm cuentas fluorescentes adquiridos con EPI y microscopía TIRF. A. Muestra imágenes del PAI de un campo de visión con perlas de varias docenas de 100 nm fluorescentes. Las flechas señalan a los granos rojos que se han asentado en el portaobjetos de vidrio, mientras que las flechas azules señalan a los granos que se están difundiendo en el agua. B. Muestra una imagen TIRF del mismo campo de visión, como se muestra en A. En este punto de vista sólo las cuentas de adherentes mostrado por las flechas rojas son visibles. Esto es porque estos se habían asentado en el coverlsip de vidrio y fueron por lo tanto dentro del campo de ~ 100 nm evanescente. Las cuentas se muestra en una de las flechas azules no están dentro de esta región y por tanto son invisibles en las imágenes TIRF. Las parcelas inferiores muestran la representación 3D de las imágenes. Es evidente que un gran aumento en relación señal-ruido se produce porque las cuentas en el campo evanescente cuando se observan al microscopio TIRF. De hecho, para estas imágenes la relación señal-ruido de EPI fue de 7,1 ± 0,6, mientras que para TIRF fue de 20 ± 0,7.

Figura 3. Imágenes de los astrocitos cargados con Fluo-4 tinte indicador de calcio adquiridos con EPI y microscopía TIRF. A. EPI imágenes de un campo de visión con cinco astrocitos. B. Un TIRF imagen del mismo campo de visión se muestra en B. Nótese que las imágenes de A y B son significativamente diferentes. Esto es porque con TIRF única iluminación de las regiones membrana plasmática en estrecha aposición a la cubreobjetos se va a examinar. Los paneles inferiores muestran ATP-evocó los transitorios de calcio intracelular con imágenes de EPI y microscopía TIRF.

Discusión

Es un hecho bien establecido que los astrocitos mostrar elevaciones de calcio intracelular. Esto ocurre de forma espontánea, puede ser desencadenada por la actividad neuronal o por la aplicación de agonistas para activar los receptores en la superficie de los astrocitos ^11. Una cuestión importante y polémica es si los astrocitos elevaciones de calcio intracelular puede desencadenar la liberación de moléculas de señalización que activan los receptores en las neuronas ^{11, 12.} Esto es controvertido porque no ha ha...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1	Tool	VWR international	48380-068
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P0899
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Reagent	Sigma-Aldrich	L2020
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid	Reagent	Invitrogen	14155-063
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red	Reagent	Invitrogen	51200-038
Penicillin-Streptomycin liquid	Reagent	Invitrogen	15140-122
Sodium pyruvate solution	Reagent	Sigma-Aldrich	S8636
HEPES solution 1 M	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
N-2 Supplement (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	17502-048
Horse Serum, Heat-Inactivated	Reagent	Invitrogen	26050-088
PAPAIN-022	Reagent	Worthington Biochemical	LK003178
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red	Reagent	Invitrogen	12348-017
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid	Reagent	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	25030-149
Cell Strainers	Tool	BD Biosciences	352350
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile	Tool	BD Biosciences	353046
NaCl	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	Reagent	Sigma-Aldrich	P3911
CaCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	21108
MgCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M2670
HEPES free acid	Reagent	Sigma-Aldrich	H3375
D-(+)-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	F-14217
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	P-3000MP
Immersion Oil TYPE DF	Microscope	Cargill Labs	16242
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume	Tool	Warner Instruments	64-0362 (RC-21BDW)
P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater	Tool	Warner Instruments	64-0278 (P-2)
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids	Reagent	Invitrogen	F8803