מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

Summary

אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.

Abstract

המוח מכיל ותאי גלייה. האסטרוציטים, סוג של תא גליה, כבר מזמן ידוע לספק תפקיד תומכת פסיבית נוירונים. עם זאת, הראיות עולה כי הגדלת האסטרוציטים יכולים גם להשתתף באופן פעיל תפקוד המוח דרך אינטראקציות פונקציונלי עם הנוירונים. עם זאת, היבטים בסיסיים רבים של הביולוגיה astrocyte נותרו שנויים במחלוקת, לא ברור ו / או נחקרו בניסוי. נושא אחד חשוב בדינמיקה של הארעיים סידן תאיים ב האסטרוציטים. זה רלוונטי כי סידן הוא הקים גם שליח שנייה חשוב כי זה הוצע כי הגבהים סידן astrocyte יכול לעורר את שחרורו של משדרי של האסטרוציטים. עם זאת, לא היתה כל תיאור מפורט או מספקת של סידן קרום ליד הפלזמה איתות האסטרוציטים. סך הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) מיקרוסקופיה הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח אירועים איתות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתוך כ 100 ננומטר של קרום הפלזמה של תאים חיים. כאן, אנו משתמשים במיקרוסקופ TIRF ולתאר כיצד לפקח ליד הממברנה הפלסמטית והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי כמעט בו זמנית. חידוד נוסף יישום שיטתי של גישה זו יש פוטנציאל להודיע ​​על פרטים מדויקים של איתות סידן astrocyte. הבנה מפורטת של הדינמיקה סידן astrocyte עלול לספק בסיס להבנה אם, איך, מתי ולמה האסטרוציטים ונוירונים לעבור סידן תלויי אינטראקציות תפקודית.

Protocol

ניסיונית נהלים

הליך הניסוי מורכב משני חלקים מרכזיים המתוארים בצורה צעד חכם למטה.

חלק 1: הכנת לתרבויות ASTROCYTE בהיפוקמפוס

בקצרה, מעורבים ההיפוקמפוס astrocyte-נוירון תרבויות הוכנו באמצעות פרוטוקול מבוסס היטב ^1,2,3. אנו אופטימיזציה הליך להניב האסטרוציטים תרבותי בריא. כל הנהלים המפורטים להלן אמור להתבצע בסביבה סטרילית כמו מכסה המנוע זרימה למינרית.

הכנת coverslips

• 22 מ"מ coverslips (VWR, 48380-068)
• Poly-D-ליזין (PDL, סיגמה P0899), aliquots (1 מ"ג / מ"ל)
• Laminin aliquots (20 מיקרוגרם / מ"ל): להוסיף 49 מ"ל של מים סטריליים עד 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון laminin (Sigma L2020), לעשות aliquots 1.2 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C

1. ממיסים PDL במים סטריליים (50 מיקרוגרם / מ"ל)
2. החיטוי coverslips, לשטוף עם מים סטריליים במקום ב PDL (20 מ"ל עבור 100 coverslips). השאירו בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
3. החלף PDL עם מים סטריליים (3 שוטף נרחב). לאחר מכן לייבש את coverslips ולאחסן ב 4 ° C.
4. יום לפני ציפוי האסטרוציטים, coverslips המקום היחיד בבאר סטרילי בצלחת 6-באר (Multiwell Flat-Bottom צלחות עם מכסים, סטרילי מ BD Bioscience). שימי 400 μl של laminin על coverslip כל דגירה לילה, בחממה, כדי למנוע אידוי.

בתור

Dissection התקשורת:

• 500 מ"ל מלח מאוזן ארל של פתרון (EBSS) (1X), נוזל (Invitrogen, 14155-063)
• 5 מ"ל HEPES פתרון (Sigma, H0887)

בהיפוקמפוס התקשורת:

• 412.5 מ"ל בינוני Essential Minimum (מ) (1X), הנוזל מכיל מלחים של ארל, אך לא אדום L-גלוטמין או פנול (Invitrogen, 51200-038)
• 10 מ"ל גלוקוז (Sigma, D-(+), גלוקוז anhydrous SIGMA ULTRA G7528) 1 M ב ממ
• 5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-122)
• Pyruvate 5 מ"ל נתרן פתרון (Sigma, S8636)
• 12.5 מ"ל HEPES פתרון 1 M (Sigma, H0887)
• 5 מ"ל N-2 מוסף (100x), נוזל (Invitrogen, 17502-048)
• 50 מ"ל סרום סוס, חום מומת (Invitrogen, 26050-088)

Papain פתרון:

• הוסף 5 מ"ל של התקשורת לנתיחה לתוך בקבוקון PAPAIN-022 וורטינגטון (LK003178; הריכוז הסופי, 20 U / ml) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.

1. לערוף גורים בני חולדה P1 (בדרך כלל 2 גורים) בעקבות הנחיות בדקה ואושרה על ידי תקנות לאומיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים המקומי ועדת שימוש.
2. הסרה של עור הגולגולת והמוח מקום בצלחת פטרי מלאות התקשורת לנתיחה קר.
3. הוסר קרומי המוח, לנתח את שתי ההמיספרות ו לנתח hippocampi.
4. קוצצים את hippocampi אל ~ חתיכות 1x1 מ"מ לעכל בפתרון papain על 37 מעלות צלזיוס במשך 11-13 דקות.
5. לאחר פיסות הרקמה התיישבו, להסיר בזהירות papain להוסיף 5 מ"ל של מדיום בהיפוקמפוס כדי להסיר כל עקבות של האנזים. חזור על שלב זה resuspend במדיום בהיפוקמפוס (2 מ"ל).
6. Triturate התאים ~ 5 פעמים עד שאין גושים שמאל, עם שלושה להבה מלוטש pipettes של טרחנים קטנים יותר ויותר (1000 מיקרומטר, 500 מיקרומטר ו ~ ~ 300 מיקרומטר).
7. Triturated פעם אחת, להעביר את התאים דרך מסננת תא (גודל הנקבוביות, 70 מיקרומטר, BD Bioscience). ספירת התאים μl 10 ההשעיה. כוון את עוצמת הקול של המדיום בהיפוקמפוס כדי שיהיה 400,000 תאים / מ"ל.
8. לשאוב את laminin coverslips, ולפני מכסה את יכולה יבש, 200 צלחת μl של ההשעיה תא לכל coverslip.
9. עזוב אותם לצרף דקות 60 בחממה, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של מדיום בהיפוקמפוס בכל טוב.
10. למחרת, לשאוב בינוני בהיפוקמפוס הישן כדי להסיר תאים מתים ופסולת ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום מראש חימם בהיפוקמפוס טריים.

תחזוקה

Neurobasal התקשורת:

• 500 מ"ל neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
• 10 מ"ל B27 בסרום תוספת חינם (Invitrogen, 17504-044)
• 5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-122)
• 1.25 מ"ל L-גלוטמין (Invitrogen, 25030-149)

הזנת ה-astrocyte נוירון תרבויות פעמיים בשבוע עם המדיום neurobasal, החל ארבעה ימים לאחר ציפוי. Preincubate התקשורת על 30 דקות בחממה בבקבוק מאוורר לאזן את הטמפרטורה ו-CO _2.

חלק 2: הדמיה סידן

הקלטה חיץ בהיפוקמפוס: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1.8 mM CaCl _2, 0.8 mM MgCl _2, 10 mM D-גלוקוז, HEPES 10 מ"מ (כל כימיקלים Sigma) 7.4 pH (מנוכה עם NaOH).

טוען אינדיקטור צבע סידן לתוך האסטרוציטים

1. מניחים את התרבות בבאר בצלחת 6-טוב מלא 2 חיץ מ"ל בהיפוקמפוס הקלטה המכיל 2.5 מיקרומטר Fluo-4, בבוקר (Invitrogen, F-14217) ו Pluronic 0.05% ® פתרון ה-F-127 20% DMSO (Invitrogen, P-3000MP) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10-30 דקות.
2. הסר Fluo-4 פתרון ולשטוף coverslips 3 פעמים עם חיץ הקלטה דגירה בהיפוקמפוס בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
3. מניחים את coverslip על החדר, לנקות את הצד השני של coverslip עם נוזל לניקוי עדשות.
4. לשים טיפה אחת קטנה של שמן טבילה (שמן טבילה TYPE DF מ Cargille) על המטרה ולשים תא (תא פתוח coverslip 25 מ"מ עגול מבית וורנר מכשירים) על הבמה של המיקרוסקופ (אולימפוס IX71).
5. תראו את התאים באמצעות שידור אור כדי לראות כיצד התאים נראים, ולקבל אותם אל המוקד. ואז להאיר את התאים עם 488 ננומטר מתוך monochromator (צבעוני V מ עד Vision) ולקבוע אם האות פלואורסצנציה של Fluo-4 הוא אחיד לזיהוי האסטרוציטים.
6. השתמש EPI ו TIRF תאורה למדוד סידן האסטרוציטים.

TIRF מיקרוסקופיה

בקצרה, אנו משתמשים במיקרוסקופ IX71 אולימפוס מצויד במצלמה iXon אנדור EMCCD DV887DCS. השליטה של ​​עירור ורכישת התמונה מושגת באמצעות תוכנת TILLVision. הקורות של 454/488/515 ננומטר ארגון (100 mW) ו - 442 ננומטר של מצב מוצק (45 mW) לייזרים משולבים ומבוקר עם עד Polyline לייזר combiner, מעבה TIRF נמל כפול ולסנן tuneable acoustoptical הבקר (AOTF; כל מ עד Photonics) ו fed לתוך סיב הלהקה Kineflex רחבה לכניסה הקבל TIRF. אנו משתמשים 60x עדשת אולימפוס 1.45 NA להשיג TIRF. לזכות המצלמה מותאמת עבור כל astrocyte לספק את האות הטוב ביותר לתמונות רעש. הרקע והעקרונות של מיקרוסקופיה TIRF נבדקו לאחרונה ^{4, 5.} מרבית הרכיבים האופטיים אנו משתמשים נרכשו מ עד Photonics, המהווה כיום חלק Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). עומק החדירה TIR ניתן לחשב משוואות להלן.

d = חדירה לעומק

n1 = מקדם השבירה של זכוכית

= n2 מקדם השבירה של התא

זווית = של שכיחות

נאי = הצמצם המספרי של שכיחות

על מנת להבטיח את הלייזר מיושר בצורה אופטימלית עבור TIRF אנו מוצאים את זה שימושי כדי לצפות 100 ננומטר פלורסנט חרוז (Invitrogen, F8803). אנו מציגים עדיין מסגרות וקטעי וידאו של חרוזים עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. כאשר ב TIRF, אחד מציין עלייה דרמטית האות לרעש-to-וחרוזים התצוגה דיפוזיה בראונית. אנחנו מוצאים את זה שימושי כדי לבחון את התנהגותם של 100 ננומטר חרוזים עם מיקרוסקופיה TIRF על בסיס קבוע (~ פעם בשבוע) כדי להיות בטוח כי TIRF אופטימלי מתרחש, ולא בתאורה אלכסונית נפגעת כי היה להתרחש אם זווית ביקורתית לא היו שווים α (ראה איור 1).

יישום ה-G-חלבון אגוניסטים לקולטן מצמידים

האסטרוציטים להביע מגוון של GQ מצמידים קולטנים ^{6, 7} כולל קולטני גלוטמט metabotropic ואת הקולטנים P2Y (אגוניסט, ATP, ADP). ההפעלה של רצפטורים אלו מוביל עליות משמעותיות רמות הסידן בתוך האסטרוציטים תאיים. למשל, אפשר בקלות להבחין הגבהים סידן תאיים במהלך היישום של ה-ATP (30 מיקרומטר) ל ^8-10 האסטרוציטים. אנו משתמשים פתרון מהיר switcher מ וורנר מכשירים שנקרא VC-77SP Fast-Step System זלוף (http://www.warneronline.com/index.cfm). עם פתרונות בשיטה זו ניתן ליישם בתוך פחות מ ~ 10 מילישניות.

באיור 1. קריקטורה ותצלומים של הדמיה להגדיר. א מציג תצלום של המיקרוסקופ רכוב על airtable, ואילו (ב) מראה תמונה של האסיפה לייזר, בקרי ותיבות הקורה. ג מציג תמונה של הבמה מיקרוסקופ עם תא רכוב הדמיה. משמאל המכשיר זלוף מהיר ניתן לראות (יחד עם מנוע צעד צינורות תטא). מימין headstage של מגבר Axopatch 200A נתפסת. הקריקטורה schematizes נתיב האור להגדיר את מעלה כמה TIRF מושגת. הלייזר מתמקדת במישור המוקד האחורי של העדשה 60x NA 1.45 אובייקטיבי מעמדה מותאם מחוץ למרכז כך עולה לתוך השמן טבילה ב α זווית ביקורתית. בשלב זה קרן סובל השתקפות פנימית מוחלטת דועך עם λ מרחק (ראו משוואה בטקסט הראשי) לתוך המדיום של מקדם השבירה נמוך. במקרה זה מדובר החיץ שמסביב הקלטה האסטרוציטים ואת האסטרוציטים עצמם. התוצאה היא עירור אופטי (ובכך הדמיה) של מולקולות בתוך ~ 100 ננומטר של הממברנה הפלסמטית. בקריקטורה של התא הזה מוצג ירוק קולטנים "נרגש" קרום, ואילו אלה בתוך התא או על המשטח העליון של התא הם לא מתרגשים. החשבון המלא של מיקרוסקופיה TIRF סופק על ידי Steyer ו Almers ^4.

איור 2. תמונות של 100 ננומטר חרוזי ניאון רכשה עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. א מציג תמונות EPI של שדה הראייה עם כמה עשרות חרוזי 100 ננומטר ניאון. נקודת החצים האדומים כדי חרוזים כי יש התיישבו על coverslip הזכוכית, בעוד ראשי חץ כחול הצבע חרוזים כי הם לשדר במים. ב 'מציג תמונה TIRF של אותו שדה הראייה כפי שמוצג א בתצוגה זו רק את החרוזים חסיד שמוצג על ידי החיצים האדומים הם גלויים. הסיבה לכך היא כי אלה התיישבו על coverlsip הזכוכית היו אפוא בתחום 100 ננומטר ~ חלוף. חרוזים שמוצג על ידי החצים הכחולים אינם בתוך האזור הזה הם בלתי נראים אפוא את התמונות TIRF. מגרשים התחתון להראות טיוח 3D של התמונות. ברור כי עלייה גדולה האות לרעש-to-מתרחש עבור חרוזים בתחום חלוף כאשר נצפתה על ידי מיקרוסקופ TIRF. למעשה, עבור תמונות אלו את האות לרעש עבור EPI היה 7.1 ± 0.6, ואילו TIRF זה היה 20 ± 0.7.

איור 3. תמונות של האסטרוציטים עמוסה Fluo-4 צבע סידן אינדיקטור רכשה עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. א EPI תמונות של שדה הראייה עם חמישה האסטרוציטים. ב התמונה TIRF של אותו שדה הראייה שמוצג ב הערה כי תמונות A ו-B הם שונים באופן משמעותי. הסיבה לכך היא כי עם TIRF תאורה רק הממברנה הפלסמטית האזורים הפרד קרוב coverslip הזכוכית הם צילמו. לוחות נמוך להראות ATP-עורר הארעיים סידן תוך תאי צילמו עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF.

Discussion

היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים להציג הגבהים סידן תוך תאי. אלה מתרחשות באופן ספונטני, יכול להיות מופעלות על ידי הפעילות העצבית או על ידי יישום של אגוניסטים כדי להפעיל את הקולטנים על פני השטח astrocyte ^11. נושא אחד חשוב במחלוקת היא האם astrocyte הגבהים סידן תוך תאי יכול לעורר את שחרורו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1	Tool	VWR international	48380-068
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P0899
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Reagent	Sigma-Aldrich	L2020
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid	Reagent	Invitrogen	14155-063
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red	Reagent	Invitrogen	51200-038
Penicillin-Streptomycin liquid	Reagent	Invitrogen	15140-122
Sodium pyruvate solution	Reagent	Sigma-Aldrich	S8636
HEPES solution 1 M	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
N-2 Supplement (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	17502-048
Horse Serum, Heat-Inactivated	Reagent	Invitrogen	26050-088
PAPAIN-022	Reagent	Worthington Biochemical	LK003178
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red	Reagent	Invitrogen	12348-017
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid	Reagent	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	25030-149
Cell Strainers	Tool	BD Biosciences	352350
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile	Tool	BD Biosciences	353046
NaCl	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	Reagent	Sigma-Aldrich	P3911
CaCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	21108
MgCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M2670
HEPES free acid	Reagent	Sigma-Aldrich	H3375
D-(+)-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	F-14217
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	P-3000MP
Immersion Oil TYPE DF	Microscope	Cargill Labs	16242
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume	Tool	Warner Instruments	64-0362 (RC-21BDW)
P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater	Tool	Warner Instruments	64-0278 (P-2)
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids	Reagent	Invitrogen	F8803