La disección de cerebro de los primates no humanos en el espacio estereotáxica

Resumen

Los primates no humanos es una importante especie de traslación para nuestra comprensión del proceso normal del cerebro. La organización anatómica del cerebro de los primates puede proporcionar información importante sobre las condiciones normales y patológicas en los seres humanos.

Resumen

El uso de primates no humanos proporciona un excelente modelo de traslación para nuestra comprensión de los procesos de desarrollo y el envejecimiento en los seres humanos

Protocolo

Parte 1: Pre-procesamiento de tejidos

1. Tejido debe ser buena perfusión con paraformaldehído, glutaraldehído, o formalina. Esto se puede lograr a través de la perfusión estándar transcardial normalmente se utiliza para la cosecha de otros órganos. En el presente estudio el tema fue profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente exsanguinated.This es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro).

Parte 2: estereotáxica bloqueo

1. Antes de colocar la cabeza en el marco estereotáxico las coordenadas del plano cero Horsley-Clarke/interaural hay que tener. Este es el punto medio teórico entre las orejas. Para medir este plano, las barras del oído deben ser igualmente instalado en el aparato, coloque una hoja de bisturí en el brazo manipulador estereotáxica y medir el punto medio entre las barras de oído. Esto es importante para determinar dónde para bloquear el tejido sobre la base de las necesidades de investigación. Una vez completado el cráneo tiene que estar preparado para la fijación en el aparato estereotáxico.
2. Con el fin de colocar la cabeza en el marco estereotáxico la mandíbula inferior tendrá que ser removido con pinzas para los huesos y un bisturí. Además de la piel, músculo y tejido conjuntivo debe ser removido para exponer el cráneo. Una vez que el tejido conectivo es extraído del cráneo, exponer el cerebro por socavando la bóveda craneal (la parte de tabla del hueso occipital, así como el parietal, huesos anuncio frontal). En la parte experimento de la bóveda craneal tiene todo listo ha eliminado. Tenga cuidado de no eliminar por completo los huesos temporales, porque los canales del oído tendrá que estar intacto para colocar la cabeza en el marco estereotáxico. El resto de la materia dura debe ser removido desde el cerebro al descubierto. El cráneo está listo para ser colocado en el marco estereotáxico.
3. De la misma manera en la que se podría realizar una cirugía estereotáxica, ajustar el ojo, el paladar y bares del oído de tal manera que la cabeza esté bien fija en el aparato estereotáxico. Coloque el manipulador estereotáxica en las coordenadas predeterminadas anterior / posterior (A / P) y mover el manipulador de la cara lateral del cerebro. Baje lentamente la hoja en el cerebro, completamente levantar la hoja del cerebro, entonces se mueven en sentido medial e inferior de la hoja de nuevo. Repita estos dos pasos hasta que la hoja se ha llegado a la parte lateral del hemisferio opuesto. Con esto se completa el bloque de la corona en primer lugar. Para su posterior bloques coronal mover el manipulador de 1 cm en el eje A / P y repetir hasta que todo el cerebro ha sido bloqueado.

Parte 3: Extracción del cerebro en el cráneo

1. Retire el cabezal del marco estereotáxico y mantener el cerebro expuestos en la palma de su mano. Tratar de asegurar el cerebro ligeramente la colocación de mimos en el cerebro en la palma de su mano y coloque el dedo meñique a través de los lóbulos frontales, este movimiento reduce al mínimo del cerebro en el cráneo. A fin de evitar el secado de la superficie pial del cerebro, coloque un trozo de gasa humedecida PBS a través del cerebro. Mantenga la cabeza firme por el cráneo y socavar el resto de los huesos occipital y temporal, junto con la columna vertebral. Esto expone a los aspectos de base y laterales del cerebro. Por último eliminar cualquier resto de hueso frontal y el hueso nasal, lo que permitirá el acceso a los bulbos olfatorios. Es importante quitar el hueso frontal último porque, como se quita la base del cráneo, el cerebro se mueve un poco y los lóbulos frontales se pueden dañar en los bordes irregulares del hueso fontal. Cortar y retirar la restante materia dura. Levante con cuidado la parte frontal del cerebro, deslice el bisturí en el cerebro y el cerebro sin la del cráneo.

Parte 4: Medidas

1. Hay una serie de medidas útiles que se pueden hacer antes de la congelación. Por ejemplo, el eje A / P del cerebro con un calibrador. Además, la densidad específica puede ser medida por el peso del cerebro, la medición del volumen por el desplazamiento de agua en una probeta dividiendo el peso por el desplazamiento de volumen (Tabla 1).

Parte 5: Termina bloqueo en el cerebro.

1. Normalmente, cuando la hoja del bisturí se introduce en el cerebro no es lo suficientemente largo para penetrar por completo la totalidad de dorsal-ventral medida del cerebro. Una vez que se remueve el cerebro y las mediciones son brutos obtenidos, tomar un pañuelo de papel, corte la hoja y terminar bloqueando el cerebro a través de la parte ventral del cerebro (Figura 2).
2. Antes de la congelación de los bloques, es necesario cryoprotect el tejido de graduado soluciones de sacarosa PBS buffer (10, 20, y 30%) se mantiene a 4 ˚ C hasta que se hunde el cerebro. Normalmente se tarda una noche de incubación en el 10%, 2-3 días en el 20% y más de 3-5 días en el 30% de los bloques que se hunden hasta el fondo del recipiente. A cambio diario de the 30% de solución de sacarosa se recomienda.

Parte 6: Resultados de Representante

Hay una serie de graves medidas morfológicas que se puede hacer una vez que el cerebro ha sido extraído del cráneo. Estos incluyen una longitud / P, el peso y la densidad específica (Tabla 1). Por lo general, bloquear el cerebro en 6.7 medición de los bloques de 1 cm (Figura 1). Cada pieza se fotografiaron (Figura 2) y pueden ser más diseccionado en función de las necesidades de investigación o preparados para la congelación de soluciones de sacarosa calificado.

Tema	A Longitud / P (Mm)	Peso (Gramos)	Desplazamiento de agua (Ml)	Densidad específica (G / ml)
O2303-2-1-1	64.3	28.1	24	1.171
O5180-1	71.3	38.7	34	1.138
O2708-3-1	62.8	28.7	26	1.104
O9184-4-2	65.3	29.5	24	1.229
N459-1-14-2	68.2	31.6	26	1.215
PROMEDIO	66.38	31.32	26.8	1.171
ETS DEV	3.38	4.33	4.17	0.052

Tabla 1. Bruto mediciones morfológicas del hemisferio derecho de 5 meses de edad monos verdes

Figura 1. Esquemas de los planos coronal utilizado para bloquear el cerebro. Este es un ejemplo de un cerebro adulto vervet externalizados. Ejemplo del procedimiento de bloqueo. Las líneas verticales aquí están espaciados a 1 cm, por lo general producen siete bloques de la corona de cada hemisferio.

Figura 2. Los bloques de tejido cerebral en el espacio estereotáxico. Cada bloque se producen aproximadamente 200 secciones tomadas a 50 micras. Con este esquema de muestreo de más de 1200 secciones a través de la corteza será tomado, y un adicional de 400 a 500 del cerebelo en rodajas en el plano coronal.

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Discusión

El San Cristóbal mono verde (Chlorocebus aethiops sabeus) es un primate del viejo mundo con patrones similares y las tasas de desarrollo del cerebro cortical y subcortical a la de los seres humanos. Esta especie ha sido utilizada para modelar complejos trastornos de la conducta humana como un comportamiento ansioso, hipertensión ^{8, 9} hemisferectomía, la enfermedad de Parkinson ^10, la enfermedad de Alzhemier de ^11, y el abuso del alcohol ^12. Más recientemente, esta...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades	Fine Science Tools	10011-00
Scissors	Fine Science Tools	14090-11	Any surgical scissors are sufficient
Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14
Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Filter paper	Fisher Scientific	09-924-150
Stereotaxic Frame	Kopf Instruments
Tissue slicing blade	Thomas Scientific