El uso del kit de la proteasa detección fluorescente para determinar la actividad de la proteasa

Resumen

El kit de detección fluorescente de la proteasa se ha diseñado para la medición de la actividad de la proteasa con fluorometría. También es adecuado para la detección de trazas de contaminación de la proteasa. El método se basa en la hydroysis proteolítica de una fórmula propia de un sustrato marcado con FITC caseína.

Resumen

El kit de la proteasa detección fluorescente proporciona listas para el uso de reactivos para detectar la presencia de actividad de la proteasa. Este ensayo simple para detectar la actividad de la proteasa utiliza caseína marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) como sustrato.

Resultados de la proteasa actividad en la escisión del sustrato de caseína marcada con FITC en fragmentos más pequeños, que no precipitan en condiciones ácidas. Después de la incubación de la muestra de la proteasa y el sustrato, la reacción se acidifica con la adición de ácido tricloroacético (TCA). La mezcla se centrifuga con el sustrato sin digerir formar una bolita y los más pequeños, fragmentos de ácido soluble que permanece en solución. El sobrenadante se neutraliza y la fluorescencia de la FITC fragmentos se mide.

El procedimiento descrito kit detecta el control de la proteasa tripsina a una concentración de aproximadamente 0,5 mg / ml (5 ng de tripsina añadido a la prueba). Esta sensibilidad se puede aumentar con un tiempo de incubación más largo, hasta 24 horas. El ensayo se realiza en tubos de microcentrífuga y los procedimientos se proporcionan para la detección de fluorescencia utilizando cubetas o placas multipocillo.

Protocolo

Instrucciones de preparación

El tampón de incubación, tampón de análisis y solución de 0,6 N TCA son siempre tan dispuestos a utilizar las soluciones.

El sustrato de FITC-caseína - Se recomienda a la alícuota del sustrato FITC-caseína en volúmenes más pequeños al llegar a evitar una repetición de los ciclos de congelación y descongelación. Si el sustrato FITC-caseína es sometido a repetidos ciclos de congelación y descongelación, un ligero aumento en el fondo va a ocurrir, por lo tanto, la reducción de la sensibilidad. Las alícuotas deben ser almacenadas a -20 ° C y protegido de la luz. Cada muestra, la reacción en blanco, o el control requiere de 20 l de sustrato de la FITC-caseína. Congelación / descongelación, así como una mezcla vigorosa o agitación puede hacer que el FITC se separe de la caseína que resulta en un fondo más alto de lectura y causa menos sustrato para estar disponible para la escisión de la proteasa.

El isotiocianato de fluoresceína (FITC) de solución de control: el control FITC puede ser reconstituida en el tampón de ensayo a la concentración adecuada. Esta solución debe ser fresco y protegido de la luz.

Final de la tripsina solución de control - añadir 100 ml de HCl 1 mM en el vial de la tripsina, la proteasa de control (código de producto T 6567). Mezclar brevemente para asegurar la tripsina se disuelve. Añadir 900 l de la incubación de amortiguación y mezclar bien. Por otra parte, los tampones se pueden utilizar otros si así lo desea para el ensayo. La concentración final de trabajo de la tripsina es de 20 mg / l. Cuando esté listo para preparar la solución de control de la tripsina, combine una parte alícuota de la solución de tripsina ácida con la cantidad correcta del tampón de incubación (1 tripsina acidificada parte a 9 partes de búfer). Almacenamiento de la tripsina en condiciones ácidas aumenta la estabilidad de la tripsina. La solución de control de la tripsina es sensible a la temperatura y no es estable a bajas concentraciones.
Por favor revise el boletín técnico del kit para el almacenamiento y la estabilidad de las soluciones preparadas.

Procedimiento

1. Es más fácil preparar los controles, los espacios en blanco, y todas las muestras a la vez. Para cada muestra, se añaden 20 l de tampón de incubación, 20 l de FITC-caseína sustrato, y 10 l de la muestra a un tubo de microcentrífuga. Para muestras con actividad de proteasa elevada, dilución de la muestra puede ser necesaria.
2. Preparación de muestras de control adecuadas (ver muestras de control) mediante la adición de 20 l de tampón de incubación, 20 l de FITC-caseína sustrato, y 10 l de la muestra de control a un tubo de microcentrífuga.
3. Preparar una muestra en blanco por la adición de 20 l de tampón de incubación, 20 l de FITC-caseína sustrato, y 10 l de agua ultrapura para un tubo de microcentrífuga.
4. Mezclar suavemente cada tubo y se incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 60 minutos. Tenga cuidado de no mezclar con demasiada fuerza, como la turbulencia excesiva puede provocar la fluorescencia de fondo de alta y reducir la sensibilidad de la prueba.
   Nota: El tiempo de incubación puede extenderse hasta 24 horas para aumentar la sensibilidad. Tenga cuidado de no exceder de 24 horas como el FITC-caseína puede empezar a degradarse, lo que la fluorescencia de fondo de alta.
5. Después de la incubación añadir 150 ml de la solución 0,6 N de ácido tricloroacético a cada tubo de microcentrífuga. TCA es muy corrosivo y debe ser manejado mientras esté usando el equipo de protección adecuado.
6. Mezclar suavemente e incubar a 37 ° C en la oscuridad durante 30 minutos.
7. Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 10.000 x g. El sobrenadante contiene el ácido soluble en fragmentos, marcado con FITC y se utiliza para la medición de fluorescencia.

Las mediciones de fluorescencia

Estos métodos se pueden escalar hacia arriba o abajo de acuerdo a los requisitos de la instrumentación disponible. Por comparación con una curva estándar preparada con las muestras de control adecuadas, restar la lectura de fluorescencia de la muestra en blanco (FLUblank) del valor de cada muestra (FLUtest).

Cubetas

1. Pipeta de 10 l de sobrenadante (paso 7) y 1 ml de tampón de ensayo en una cubeta adecuada y mezclar suavemente. Nota: La solución del tampón de ensayo sobrenadante y se pueden almacenar en la oscuridad a 2-8 ° C hasta 24 horas antes de la medición de la fluorescencia.
2. Registro de la intensidad de fluorescencia con excitación a 485 nm y el control de la longitud de onda de emisión de 535 nm.

Placas de pocillos múltiples

1. Pipeta de 10 l de la Nota sobrenadante (paso 7) y 1 ml de tampón de ensayo en un tubo adecuado o vial y mezclar suavemente: La solución del tampón de ensayo sobrenadante y se pueden almacenar en la oscuridad a 2-8 ° C hasta 24 horas antes de la medición de la fluorescencia.
2. Transferencia de 200 l en un pozo negro de una placa de 96 pocillos. Registro de la intensidad de fluorescencia con excitación a 485 nm y el control de la longitud de onda de emisión de 535 nm.
   O

1. Pipetear 2 l de sobrenadante (paso 7) y 200 l de la B Ensayouffer en un pozo negro de una placa de 96 pocillos. Nota: La solución del tampón de ensayo sobrenadante y se pueden almacenar en la oscuridad a 2-8 ° C hasta 24 horas antes de la medición de la fluorescencia.
2. Registro de la intensidad de fluorescencia con excitación a 485 nm y el control de la longitud de onda de emisión de 535 nm.

Las muestras de control

La solución de control de tripsina se puede utilizar para confirmar la prueba está funcionando correctamente, para determinar el límite de detección, o crear una curva estándar general. Para el ensayo de una proteasa diferentes y específicos, se recomienda preparar una solución de control que contiene la proteasa específica en el tampón de incubación apropiado.

El límite de detección del ensayo es la cantidad de la proteasa, que produce una lectura significativa de fluorescencia por encima del valor obtenido con la muestra en blanco. El límite de detección pueden variar dependiendo de la sensibilidad de la instrumentación. Diluciones seriadas de la solución de control de tripsina puede ser utilizado para generar las soluciones de control.

A igualdad de la lectura al 120% del valor obtenido con la muestra en blanco se considera significativo. Habitualmente, un límite de detección de 5 ng de tripsina se obtuvo con este procedimiento. Se recomienda que al menos un 5 ng de control de la tripsina se ejecute con cada ensayo. Una solución de control de tripsina con una concentración de 0,5 mg / ml daría lugar a la deseada 5 ng de tripsina en el ensayo. Una dilución de 40 veces de la solución de control de la tripsina (20 ug / ml) resulta en una solución de control de 0,5 mg / ml, es decir, una parte de la solución de control de tripsina a 39 partes de tampón de incubación.

Figura 1 (curva estándar de actividad de la tripsina): La solución de control de tripsina (20 ug / ml) también se puede utilizar para generar una curva estándar al hacer diluciones en serie (ver Figura 1). La lectura de la fluorescencia de cada muestra de control se corrigió restando la lectura de la fluorescencia de la muestra en blanco (FLUblank) del valor de cada muestra de control (FLUcontrol).

Típica curva estándar de tripsina (Código de producto T 6567) con el kit y las muestras de control que van desde 0,15 mg / ml (1,5 ng) a 2,5 mg / ml (25 ng). Esta curva se generó mediante el procedimiento descrito, con un tiempo de incubación de 30 minutos para el paso 4. Medidas de fluorescencia se realizaron en una placa de pocillos múltiples.

Isotiocianato de fluoresceína se presenta como un control para la calibración de los instrumentos posibles (vea las instrucciones del proveedor) o la determinación del rango de linealidad de la señal de FITC.

Discusión

Acabamos de mostrar un ensayo ejemplo usando el kit de la proteasa detección fluorescente para detectar la actividad de la proteasa en una muestra biológica. Este kit ha sido optimizado para detectar una amplia variedad de proteasas que se encuentran en las aplicaciones fisiológicas. Es adecuado para la detección de la serina, la cisteína, Metallo, y proteasas aspártico, sin embargo, las modificaciones pueden ser necesarias para detectar algunas proteasas específicas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Fluorescent Detection Kit	Sigma-Aldrich	PF0100
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758