L'uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l'attività della proteasi

Riepilogo

Il fluorescente Detection Kit proteasi è progettato per la misurazione dell'attività della proteasi con fluorometria. E 'anche adatto per il rilevamento di tracce di contaminazione della proteasi. Il metodo si basa sulla hydroysis proteolitica di una formulazione proprietaria di un marcato con FITC substrato di caseina.

Abstract

Il fluorescente Detection Kit proteasi fornisce pronti per l'uso-reagenti per la rilevazione della presenza di attività della proteasi. Questo semplice test per rilevare l'attività della proteasi utilizza la caseina marcato con isotiocianato di fluorescina (FITC) come substrato.

L'attività della proteasi risultati nella scissione del substrato caseina coniugati con fluoresceina in frammenti più piccoli, che non precipitare in condizioni di acidità. Dopo l'incubazione del campione proteasi e substrato, la reazione è acidificato con l'aggiunta di acido tricloroacetico (TCA). La miscela viene poi centrifugato con il substrato digerito formando una pallina e la più piccola, frammenti di acido solubile rimane in soluzione. Il supernatante viene neutralizzata e la fluorescenza della marcata con FITC frammenti viene misurato.

La procedura descritta kit rileva il controllo della proteasi tripsina ad una concentrazione di circa 0,5 mg / ml (5 ng di tripsina aggiunto al test). Questa sensibilità può essere aumentata con un tempo di incubazione più lungo, fino a 24 ore. Il test viene eseguito in provette da microcentrifuga e le procedure sono previste per la rilevazione di fluorescenza utilizzando cuvette o piastre a pozzetti multipli.

Protocollo

Istruzioni per la preparazione

Il tampone di incubazione, tampone del saggio, e 0,6 N Soluzione TCA sono forniti pronti per l'uso-solutions.

La FITC-caseina substrato - Si consiglia di aliquota con FITC caseina substrato in volumi più piccoli al loro arrivo al fine di evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo. Se il FITC-caseina substrato è sottoposta a ripetuti cicli di gelo e disgelo, un leggero aumento del fondo avverrà, quindi, abbassando la sensibilità. Le aliquote devono essere conservati a -20 ° C e al riparo dalla luce. Ogni campione, reazione vuoto, o di controllo richiede 20 microlitri della FITC-caseina substrato. Gelo / disgelo e vigorosa miscelazione o agitazione può causare la FITC a separarsi dal caseina con conseguente maggiore sfondo lettura e causando meno substrato ad essere disponibile per la scissione della proteasi.

L'isotiocianato di fluoresceina (FITC) Soluzione di controllo-Il controllo FITC può essere ricostituito nel tampone del saggio alla concentrazione adeguata. Questa soluzione deve essere fresco e al riparo dalla luce.

Soluzione finale della tripsina di controllo - Aggiungere 100 ml di 1 mM HCl al flaconcino di tripsina, proteasi Control (Product Code T 6567). Miscelare brevemente per garantire la tripsina è sciolto. Aggiungere 900 ml di tampone di incubazione e mescolare bene. In alternativa, i buffer possono essere utilizzati altri se lo si desidera per il test. La concentrazione finale di lavoro della tripsina è di 20 mg / mL. Quando si è pronti per preparare la soluzione di controllo tripsina, combinano una aliquota della soluzione acida tripsina con la giusta quantità di Incubation Buffer (1 tripsina acidificato parte a 9 tampone parti). Memorizzazione della tripsina in condizioni acide aumenta la stabilità della tripsina. La soluzione di controllo tripsina è sensibile alla temperatura e non è stabile a basse concentrazioni.
Si prega di rivedere bollettino tecnico del kit per la conservazione e la stabilità di queste soluzioni preparate.

Procedura

1. È più facile preparare i controlli, spazi vuoti, e tutti i campioni in una sola volta. Per ogni campione, aggiungere 20 ml di tampone di incubazione, 20 l di FITC-caseina substrato, e 10 ml di campione in una provetta da microcentrifuga. Per i campioni di prova con l'attività della proteasi alta diluizione del campione può essere richiesto.
2. Preparare i campioni di controllo appropriate (vedere Esempi di controllo) con l'aggiunta di 20 l di tampone di incubazione, 20 l di FITC-caseina substrato, e 10 ml di campione di controllo di una provetta.
3. Preparare un campione in bianco con l'aggiunta di 20 l di tampone di incubazione, 20 l di FITC-caseina substrato, e 10 ml di acqua ultrapura in una provetta da microcentrifuga.
4. Mescolare delicatamente ogni tubo ed incubare a 37 ° C al buio per 60 minuti. Fare attenzione a non mescolare troppo energicamente, come turbolenza eccessiva può causare alta fluorescenza di fondo e di ridurre la sensibilità del test.
   Nota: il tempo di incubazione può essere prolungato fino a 24 ore per aumentare la sensibilità. Fare attenzione a non superare 24 ore come FITC-caseina può cominciare a degradare, portando ad alta fluorescenza di fondo.
5. Dopo l'incubazione aggiungere 150 microlitri della soluzione 0,6 N di acido tricloroacetico ad ogni provetta. TCA è molto corrosivo e deve essere maneggiato mentre indossa l'equipaggiamento protettivo idoneo.
6. Mescolare delicatamente e incubare a 37 ° C al buio per 30 minuti.
7. Centrifugare le provette per 10 minuti a 10.000 x g. Il supernatante contiene il solubile acido, frammenti marcato con FITC ed è utilizzato per la misurazione della fluorescenza.

Misure di fluorescenza

Questi metodi possono essere scalato verso l'alto o verso il basso a seconda delle esigenze della strumentazione disponibile. Per il confronto con una curva standard preparata con i campioni di controllo adeguati, sottrarre la lettura di fluorescenza del campione in bianco (FLUblank) dal valore di ciascun campione (FLUtest).

Cuvette

1. Pipettare 10 ml di surnatante (passo 7) e 1 ml di tampone del saggio nella cuvetta adatto e mescolare delicatamente. Nota: la soluzione del Buffer surnatante e di analisi possono essere conservati al buio a 2-8 ° C fino a 24 ore prima di misurare la fluorescenza.
2. Registrare l'intensità di fluorescenza con eccitazione a 485 nm e il monitoraggio della lunghezza d'onda di emissione di 535 nm.

Pozzetti Piastre

1. Pipettare 10 ml di nota surnatante (punto 7) e 1 ml di tampone del saggio in un tubo adatto o fiala e mescolare delicatamente: la soluzione del Buffer surnatante e di analisi possono essere conservati al buio a 2-8 ° C al massimo a 24 ore prima di misurare la fluorescenza.
2. Trasferire 200 ul di un pozzo nero di una piastra da 96 pozzetti. Registrare l'intensità di fluorescenza con eccitazione a 485 nm e il monitoraggio della lunghezza d'onda di emissione di 535 nm.
   O

1. Pipettare 2 ml di surnatante (passo 7) e 200 microlitri della B AssayUffer in un pozzo nero di una piastra da 96 pozzetti. Nota: la soluzione del Buffer surnatante e di analisi possono essere conservati al buio a 2-8 ° C fino a 24 ore prima di misurare la fluorescenza.
2. Registrare l'intensità di fluorescenza con eccitazione a 485 nm e il monitoraggio della lunghezza d'onda di emissione di 535 nm.

Campioni di controllo

La soluzione di controllo Tripsina può essere utilizzato per confermare il test funziona correttamente, per determinare il limite di rilevazione, o creare una curva generale standard. Per l'analisi di un diverso, specifico della proteasi, si consiglia di preparare una soluzione di controllo contenente le proteasi specifica nel buffer di incubazione appropriato.

Il limite di rilevazione del test è la quantità di proteasi che produce una lettura significativa fluorescenza al di sopra del valore ottenuto con il campione bianco. Il limite di rilevazione varia a seconda della sensibilità della strumentazione. Diluizioni seriali della soluzione di controllo Tripsina possono essere utilizzati per generare le soluzioni di controllo.

Una lettura pari al 120% del valore ottenuto con il campione in bianco è considerato significativo. Di routine, un limite di rilevazione di 5 ng di tripsina è stato ottenuto con questa procedura. Si raccomanda che almeno un 5 ng controllo tripsina essere eseguita per ogni dosaggio. Una soluzione di controllo di tripsina con una concentrazione di 0,5 mg / ml porterebbe alla desiderato 5 ng di tripsina nel saggio. A 40 volte la diluizione della soluzione di controllo tripsina (20 mg / ml) si traduce in un mcg / 0,5 ml soluzione di controllo, cioè una parte della soluzione di controllo tripsina a 39 parti di tampone di incubazione.

Figura 1 (curva standard di attività tripsina): La soluzione di controllo tripsina (20 mg / ml) può anche essere usato per generare una curva standard, rendendo diluizioni seriali (vedi Figura 1). La lettura della fluorescenza di ciascun campione di controllo è stato corretto sottraendo la lettura di fluorescenza del campione in bianco (FLUblank) dal valore di ciascun campione di controllo (FLUcontrol).

Tipica curva standard per la tripsina (Codice prodotto T 6567) utilizzando questo kit e campioni di controllo che vanno da 0,15 mg / ml (1,5 ng) a 2,5 mg / ml (25 ng). Questa curva è stata generata seguendo la procedura descritta, con un tempo di incubazione di 30 minuti per il punto 4. Misure di fluorescenza sono state effettuate in un piatto pozzetti.

Isotiocianato di fluorescina viene fornito come un controllo per la calibrazione dello strumento possibile (vedere le istruzioni del produttore appropriato) o la determinazione del range di linearità del segnale FITC.

Discussione

Abbiamo appena mostrato un saggio esempio utilizzando la fluorescenza Detection Kit della proteasi per rilevare l'attività della proteasi in un campione biologico. Questo kit è stato ottimizzato per rilevare una vasta gamma di proteasi presenti nelle applicazioni fisiologiche. È adatto per il rilevamento di serina, cisteina, metallo, e aspartico proteasi, tuttavia, le modifiche possono essere tenuti a rilevare alcuni proteasi specifiche.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Fluorescent Detection Kit	Sigma-Aldrich	PF0100
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758