IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

Resumen

El método IP-FCM se presenta, lo que permite un sensible, sólida evaluación, bioquímicos nativos de interacciones proteína-proteína, sin necesidad de la ingeniería genética o muestras de gran tamaño.

Resumen

Inmunoprecipitación detectada mediante citometría de flujo (IP-FCM) es un método eficaz para la detección y cuantificación de interacciones proteína-proteína. El principio básico es extensivo de ELISA sandwich, en la cual puede ser el analito capturado primaria detectados junto con otras moléculas físicamente asociados dentro de los complejos multiproteico. El procedimiento consiste en el acoplamiento covalente de microesferas de látex de poliestireno con inmunoprecipitación anticuerpos monoclonales (mAb) específico para una proteína de interés, la incubación de estas cuentas con lisados ​​de células, el sondeo capturado complejos de proteínas con el conjugado a un fluorocromo sondas, y el análisis de cuentas asociadas a fluorescencia por citometría de flujo. IP-FCM es extremadamente sensible, permite el análisis de proteínas en su país natal (no desnaturalizado) del estado, y se presta a ninguno de los análisis semi-cuantitativo o cuantitativo. Como ventajas adicionales, IP-FCM no requiere de la ingeniería genética o equipo especializado, que no sea un citómetro de flujo, y puede ser fácilmente adaptada para aplicaciones de alto rendimiento.

Protocolo

** Este protocolo de vídeo se basa en una publicación asociada ^1: de alta sensibilidad de detección y análisis cuantitativo de los nativos interacciones proteína-proteína y complejos multiproteicos por citometría de flujo. Adam G. Schrum, Diana Gil, P. Elaine Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. STKE de la ciencia 2007 (389): PL2, 5 de junio de 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. Por favor, haga clic aquí para ver esta publicación .

Antes de partir, Prepare las siguientes soluciones acuosas de archivo:

MES acoplamiento Buffer:	Guárdela a 25 ° C
MES, pH 6,0	50 mM
EDTA	1 mM
Enfriamiento / Bloqueo / Almacenamiento (SBC) Buffer:	Almacenar a 4 ° C
BSA	1%
Azida de sodio	0,02%
PBS, pH 7,4	1x
FCM Buffer:	Almacenar a 4 ° C
Tris, pH 7,4	50 mM
NaCl	100 mM
Azida de sodio	0,02%
FBS	5%
PBS, pH 7,4	1x

Preparar inmediatamente antes del uso:

EDAC-MES:	Disolver 50 mg / ml polvo EDAC en tampón de acoplamiento MES
Digitonina solución (2% w / v):	Disuelva el polvo de digitonina en dH 2 O por calentamiento a 95 º C durante 5 minutos luego enfriar en hielo
Tampón de lisis:
Tris, pH 7,4	50 mM
NaCl	150 mm
Digitonina solución	1%
Inhibidores de la proteasa	1x
Mantener en hielo

1. El acoplamiento de mAb a bolas

1. Determinar la concentración de cuentas de las acciones compradas mediante la dilución en PBS y contar con un hemocitómetro. Comience con una dilución 1:10000 de cuentas para el conteo.
2. Pipeta de 18 x 10 ⁶ granos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Lavar las perlas de 2 a 3 veces en 0,5 a 1,0 ml de tampón de acoplamiento MES, centrifugado a 20.000 g durante 3 minutos a 25 ° C después de cada lavado.
4. Volver a suspender las bolas en 50 l de acoplamiento Buffer MES.
5. Activar los grupos carboxilo de las cuentas mediante la adición de 20 l de recién preparada EDAC-MES.
6. Mezclar suavemente durante 15 minutos a 25 ° C de forma manual pipeteando arriba y abajo.
7. Lave las cuentas activadas 2 a 3 veces en 0,5 a 1,0 ml de PBS, centrifugar a 20.000 g durante 3 minutos a 25 ° C después de cada lavado.
8. Volver a suspender las cuentas activadas en 50 l de PBS.
9. Añadir 50 l de la IP MAB (0.2-1.0 en la concentración de las mg / mL) a la solución de cuentas activadas.
10. Mezcle por 3 a 4 horas a 25 º C colocando el tubo en un agitador vibratorio. Agite lo suficiente como para evitar la sedimentación de los granos en la parte inferior del tubo.
11. Lave mAb-junto cuentas 2 a 3 veces en 0,5 a 1,0 ml de PBS, centrifugar a 20.000 g durante 3 minutos a 25 ° C después de cada lavado.
12. Volver a suspender las bolas en 100 l de búfer SBC. Estos pueden ser almacenadas a 4 ° C.
13. La suspensión de las cuentas así, diluir 1:200-1:10,000 en PBS y contar con un hemocitómetro. La concentración debe ser medido para cada lote de preparación, por lo que el número de granos utilizados en cada experimento IP o pull-down puede ser controlada con precisión.

2. Post-nuclear lisado preparación e Ip

El método de lisis y las condiciones óptimas de lisis dependerá del tipo de células y las interacciones entre proteínas que se examina. Una serie de protocolos existen y pueden ser modificados para su aplicación.

1. Lisis de 20 x 10 ⁶ 'pequeño' células, como los linfocitos, o 5 x 10 ⁶ "grandes" las células, como macrófagos o células tumorales, en 100 l buffer de lisis fresco en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por 20 minutos en hielo. Escala el volumen de lisis, según sea necesario.
2. Para eliminar los núcleos y restos celulares insolubles, centrifugar el lisado a 20.000 g durante 10 min a 4 ° C. Mantenga el sobrenadante y descartar el pellet.
3. Añadir 0,5 x 10 ⁵ a 2,5 x 10 ⁵ mAb-junto a las cuentas de lisado clarificado, pipetear suavemente para mezclar. El volumen mínimo que utilizamos pararealizar una sola dirección IP es de 5 mL.
4. Colocar en una vertical de rotación de la rueda 4 horas para pasar la noche en una habitación fría. Ajuste a la velocidad suficiente para evitar que las cuentas de liquidación. Es aceptable que el líquido de bajo volumen de IPs para permanecer en el fondo del tubo durante la rotación.

3. Sondeo de bolas-capturado proteínas con anticuerpos conjugados a un fluorocromo

1. Lave las cuentas IP dos veces en 0,2 a 1,0 ml de helado de buffer FCM, la centrifugación a 20.000 g a 4 ° C durante 3 min después de cada lavado.
2. Volver a suspender las bolas en 100 l de búfer y la FCM alícuota de 20 l en cada uno de cinco o más tubos de microcentrífuga de 1,5 mL o pocillos de una placa de chimenea de fondo.
3. Añadir fluorocromo conjugado AcMo a las muestras. Realizar la FCM mancha de acuerdo a las instrucciones del proveedor o de acuerdo a las concentraciones de determinados empíricamente. Como punto de partida, añadir 0,2 a 1 l de solución madre de anticuerpos (a 0.2-1.0 mg / mL) por tubo o pocillo e incubar durante 40 min en hielo.
4. Lave investigado cuentas en tubos de 1,5 ml dos veces en 1,0 ml de Buffer FCM helada, centrifugado a 20.000 g a 4 ° C durante 3 min después de cada lavado. Retire con cuidado el sobrenadante después de cada lavado, teniendo cuidado de no alterar las cuentas. Para una placa de chimenea de fondo, lavado dos veces con 0,2 ml de tampón helado FCM, centrifugar a 1000 g por 5 min a 4 ° C después de cada lavado. Una pipeta multicanal es útil para este paso. Para eliminar el sobrenadante de cuentas en una placa de chimenea de fondo, 'película' de la placa una vez, entonces, al mismo tiempo al revés, borrar cualquier goteo de los bordes de los pozos. El volumen residual en cada pozo, que contiene las cuentas, será de unos 20 mL.
5. Volver a suspender las bolas en 200 Buffer FCM l por muestra. Traslado al etiquetado tubos FACS. Las muestras ya están listos para FCM.

4. FCM Adquisición

Las cuentas de CML se describe en este protocolo son de 3 a 5 micras de diámetro, aproximadamente la mitad del diámetro de un linfocito del ratón en reposo. Por lo tanto, puede ser necesario aumentar manualmente la dispersión frontal (FSC) y la ganancia del amplificador dispersión lateral (SSC) de tensión a fin de que la población de los acontecimientos de cuentas para registrar en la escala. Individual cuentas IP deben formar una sola población cercanos entre sí. La configuración y la puerta debe ser ajustada para excluir a los dobletes de cuentas y los escombros.

1. Antes de cuentas corrientes o las normas de cuentas, quitar la funda de contención de las gotas que rodea a la entrada de la muestra en algunos citómetros. Permita que el fluido de vaina a gotear entre las muestras, ya que se borrará la entrada y evitar cuentas de ser transferidos de una muestra a otra.
2. Utilice cuentas de etiqueta, un control negativo de la fluorescencia, y las partículas de arco iris de calibración (PCR), un control positivo de fluorescencia, para ajustar la configuración para que tanto los extremos positivos y negativos de fluorescencia aparecerá simultáneamente en el diario de escala del eje X. Esto asegura que la fluorescencia de las muestras experimentales también estará en gran escala. Tenga en cuenta que los PCR son más pequeñas que las cuentas de la LMC, por lo que el FSC y los parámetros de cooperación Sur-Sur, así como la posición de la puerta, puede ser necesario modificar temporalmente para esa muestra.
3. Volver a la etiqueta de perlas ajustes una vez calibrado con PCR se ha completado. Si sólo hay una sonda fluorescente por cada muestra se utiliza, sin compensación de fluorescencia es necesario. En general, la sonda complejos multiproteicos con un solo fluorocromo conjugado AcM por muestra FCM, y se examina la interacción de múltiples socios de tinción en paralelo muestras de cordón con mAbs específicas para las varias subunidades.
4. Adquirir y guardar archivos de datos de fluorescencia. Análisis puede llevarse a cabo utilizando el software de citometría de flujo, tales como CellQuest, FlowJo o cflow.

5. Resultados representante

Figura 1. FCM-IP para el complejo multiproteico TCR/CD3. Células T de la cepa de ratones Balb / c fueron lisadas en el 1% digitonina, y el lisado fue sometido a IP-FCM con CD3ε anti-gotas. Los complejos capturados contenían cantidades significativas de TCR-β (región púrpura) y co-asociados CD3-ε (verde), pero, cerca de los niveles de fondo (que se define por la sonda inmunoglobulina irrelevante, rosa de seguimiento) de otras proteínas como Thy1.2 CD45, o H-2K (d) (marrón, naranja, azul y trazas, respectivamente). Ver resultados similares publicados previamente ^1-6.

Discusión

Información acerca de las interacciones proteína-proteína es altamente relevante para el análisis de muchos procesos celulares como la transducción de señales, la maduración del linaje, la progresión del ciclo celular, apoptosis y cascadas. IP-FCM proporciona una forma rápida, cuantitativa y sensible para examinar la interacción de las proteínas y complejos de definir los miembros de multiproteico en su conformación nativa. Cuentas se pueden acoplar y se incubaron con lisados ​​de células en un día y se puede probar y analizar al día siguiente. Un formato de placa de 96 pocillos permite un gran número de muestras a analizar a la vez que ofrezcan servicios de recogida de datos eficiente para fines estadísticos o de tamizaje. Utilizando fluorescentes estándares de cuentas, el número de proteínas capturadas por cada cuenta puede ser estimado. Muy poco material de origen es necesaria para la captura y detección, lo que las muestras limitadas y analitos escasos todavía se pueden analizar las interacciones múltiples. A pesar de IP-FCM no requiere de la ingeniería genética, epítopo de etiquetado, desnaturalización, o in vitro, la mezcla de proteínas en un entorno no-fisiológico, se puede acoplar con estas y otras técnicas, por lo que es un instrumento valioso y accesible, con aplicabilidad a muchos sistemas biológicos.

Solución de problemas:

Muchos IP-FCM experimentos generar datos útiles de interacción de proteínas de la primera vez que se intentó. Sin embargo, la optimización de IP-FCM puede mejorar la conjugación de anticuerpos a los granos, la captura de proteínas complejas, y la sonda fluorescente vinculante.

La eficiencia de la conjugación de anticuerpos IP puede ser determinado mediante el sondeo cuentas directamente acoplado con un anticuerpo anti-inmunoglobulina. Si esta eficiencia es baja, el aumento de la concentración de anticuerpos en la reacción de acoplamiento puede permitir que mayor cantidad de anticuerpos IP para conectar a cada cuenta. Esto puede aumentar la capacidad de unión de los lotes de cuentas IP, lo que resulta en la captura de mejora y la detección de analitos. Otros productos primarios-las moléculas que contienen aminas (por ejemplo, Tris, albúmina sérica bovina) no debe estar presente durante la reacción de acoplamiento, ya que pueden competir con el MAB para la fijación de cuentas y en consecuencia bajo acoplamiento mAb. Si la conjugación de mAb de cuentas resulta problemática por otras razones, en lugar de cuentas puede ser acoplado a avidina / estreptavidina, y posteriormente anticuerpos con biotina puede ser no-covalente y se utiliza para immunprecipitation.

A pesar de una buena conjugación de anticuerpos, la detección inicial de cordón-fluorescencia asociada puede ser baja. La primera captura, el complejo en sí mismo puede ser baja. Debido a que IP-FCM depende de la concentración de los analitos, lo que aumenta el número de células lisadas por unidad de volumen de lisis puede aumentar la captura y detección de analitos. Además, la captura puede ser mejorada al reducir el número de cuentas de IP se incubaron con el lisado, que distribuye a través de complejos de captura menos granos, y los resultados de la fluorescencia mayor promedio por bolas al investigado. En segundo lugar, es posible que el acceso de los anticuerpos de la sonda a los complejos de captura es estéricamente impedido por el anticuerpo inmunoprecipitación. En este caso, el problema puede abordarse mediante el uso de diferentes anticuerpos para capturar y / o la sonda.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free)	Reagent	Interfacial Dynamics	2-5000	Store at 4°C.
Rainbow Calibration Particles	Reagent	Spherotech, Inc.	RCP-30-5A	Store at 4°C.
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)	Reagent	Sigma-Aldrich	M-5287
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)	Reagent	Sigma-Aldrich	22980 E-6383	Store at -20°C under desiccating conditions.
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin	Reagent	Sigma-Aldrich	P-2714	Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves.
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney	Reagent	Fisher Scientific	08-408-230	For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining