IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

Summary

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

Abstract

Immunoprecipitation זוהה על ידי cytometry זרימה (IP-FCM) הוא שיטה יעילה לגילוי וכימות חלבונים אינטראקציות. העיקרון הבסיסי משתרע של כריך ELISA, שבה אנליטי העיקרי בשבי ניתן לאתר יחד עם מולקולות אחרות הקשורות פיזית בתוך מתחמי multiprotein. ההליך כרוך צימוד קוולנטי של microbeads לטקס קלקר עם immunoprecipitating נוגדנים חד שבטיים (מב) ספציפיים לחלבון של עניין, דוגרים אלה חרוזים עם lysates תא, חיטוט קומפלקסים חלבונים שנתפסו עם fluorochrome-מצומדות בדיקות, וניתוח חרוז הקשורים הקרינה על ידי cytometry הזרימה. IP-FCM הוא רגיש ביותר, מאפשר ניתוח של חלבונים במצב הטבעי שלהם (לא מפוגל), וכן ניתנת לניתוח או חצי כמותי או כמותי. כפי יתרונות נוספים, IP-FCM לא דורש הנדסה גנטית או ציוד מיוחד, מלבד cytometer זרימה, וזה ניתן להתאים בקלות עבור תפוקה גבוהה יישומים.

Protocol

** וידאו פרוטוקול זה מבוסס על פרסום משויך ^1: רגישות גבוהה לזיהוי ניתוח כמותי של חלבונים אינטראקציות יליד מתחמי multiprotein ידי cytometry הזרימה. אדם ג'Schrum, דיאנה גיל, איליין פ Dopfer, דוד ל 'Wiest, לורנס א Turka, וולפגנג WA Schamel, אד פאלמר. STKE המדע של 2007 (389): pl2, 5 ביוני 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. אנא לחץ כאן כדי לראות פרסום זה .

טרם החל, הכן את הפתרונות הבאים במלאי מימיות:

MES הצפת צימוד:	חנות של 25 ° C
MES, pH 6.0	50 מ"מ
EDTA	1 mM
מרווה / חסימה / Storage (QBS) חוצץ:	חנות ב -4 ° C
BSA	1%
נתרן אזיד	0.02%
PBS, pH 7.4	1x
FCM חוצץ:	חנות ב -4 ° C
טריס, pH 7.4	50 מ"מ
NaCl	100 מ"מ
נתרן אזיד	0.02%
FBS	5%
PBS, pH 7.4	1x

הכן מיד לפני השימוש:

EDAC-MES:	להמיס 50 מ"ג / מ"ל ​​אבקה EDAC הצפת זיווגים MES
Digitonin פתרון (2% w / v):	ממיסים אבקת digitonin ב DH 2 O על ידי חימום ל 95 מעלות אז הקירור 5min על הקרח
תמוגה חוצץ:
טריס, pH 7.4	50 מ"מ
NaCl	150 מ"מ
Digitonin פתרון	1%
מעכבי פרוטאז	1x
שמור על הקרח

1. צימוד של MAB כדי חרוזים

1. קבע את הריכוז של חרוזים מן המניות שנרכשו על ידי דילול ב PBS ועוד היד נטויה עם hemacytometer. התחל עם דילול 1:10000 של חרוזים עבור סופרים.
2. פיפטה 18 x 10 ⁶ חרוזים לתוך צינור 1.5-מ"ל microcentrifuge.
3. שטפו את החרוזים 2 עד 3 פעמים ב הצפת 0.5-1.0 זיווגים MES מ"ל, centrifuging ב g 20,000 במשך 3 דקות במהירות של 25 ° C אחרי כל שטיפה.
4. Resuspend את החרוזים הצפת 50 MES μL זיווגים.
5. הפעלת קבוצות carboxyl על החרוזים על ידי הוספת 20 μL של המוכן טרי EDAC-MES.
6. מערבבים בעדינות במשך 15 דקות במהירות של 25 ° C באופן ידני על ידי pipetting למעלה ולמטה.
7. שטפו את החרוזים מופעל 2 עד 3 פעמים ב 0.5-1.0 מ"ל PBS, centrifuging ב g 20,000 במשך 3 דקות במהירות של 25 ° C אחרי כל שטיפה.
8. Resuspend החרוזים מופעל 50 PBS μL.
9. הוסף 50 μL של MAB IP (בריכוז מ"ג / מ"ל ​​0.2-1.0 המלאי) לפתרון חרוז הופעל.
10. מערבבים במשך 3 עד 4 שעות ב 25 ° C על ידי הנחת הצינור על שייקר רוטט. Shake מספיק כדי למנוע התיישבות של החרוזים על החלק התחתון של הצינור.
11. לשטוף MAB מצמידים חרוזים 2 עד 3 פעמים ב 0.5-1.0 מ"ל PBS, centrifuging ב g 20,000 במשך 3 דקות במהירות של 25 ° C אחרי כל שטיפה.
12. Resuspend את החרוזים הצפת 100 QBS μL. אלה יכולים להיות מאוחסנים 4 ° C.
13. השעיית חרוזים היטב, לדלל 1:200-1:10,000 ב PBS ולספור עם hemacytometer. הריכוז חייב להיות נמדד עבור כל אצווה preparative, כך מספר חרוזים השתמשו בניסוי ה-IP או כל הנפתח ניתן לשלוט באופן מדויק.

2. פוסט גרעיני lysate הכנה Ip

השיטה תמוגה ותנאי תמוגה האופטימלי יהיה תלוי בסוג התא חלבונים אינטראקציות נבדקות. מספר פרוטוקולים קיימים יכול להיות שונה עבור היישום.

1. Lyse 20 x 10 ⁶ "קטן" תאים, כגון לימפוציטים, או 5 x 10 ⁶ "גדול" תאים, כגון מקרופאגים או תאים סרטניים, במאגר תמוגה μL 100 טרי צינור 1.5-מ"ל microcentrifuge עבור 20min על הקרח. סולם נפח תמוגה כנדרש.
2. כדי להסיר גרעינים ופסולת הסלולר מסיסים, בצנטריפוגה lysate ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant וזורקים את הכדור.
3. הוסף 0.5 x 10 x ^5-2.5 10 ⁵ מב-בשילוב חרוזים lysate הבהיר, pipetting בעדינות לתערובת. היקף מינימלי אנו משתמשים כדילבצע IP אחת היא 5 μL.
4. מניחים על אנכי מסתובב 4 שעות גלגל לילה בחדר קר. הגדר מהירות מספיק כדי למנוע את החרוזים מן ההתיישבות. זה מקובל נוזלי של בנפח נמוך כתובות IP להישאר בתחתית הצינור במהלך סיבוב.

3. גשוש של חלבון ביד שנתפסו עם Fluorochrome-מצומדות נוגדנים

1. שטפו את החרוזים IP פעמיים ב mL 0.2-1.0 קר כקרח הצפת FCM, centrifuging ב g 20,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לאחר כל שטיפה.
2. Resuspend את החרוזים 100 μL μL הצפת ו aliquot 20 FCM לתוך כל חמש או יותר 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge או בארות צלחת ארובה התחתונה.
3. הוסף fluorochrome-מצומדות מבז על דגימות. בצע FCM את הכתם על פי ההוראות של היצרן או על פי ריכוזי נקבעים אמפירית. כנקודת מוצא, להוסיף 0.2-1 μL של פתרון נוגדן המניות (ב 0.2-1.0 מ"ג / מ"ל) לכל צינורית או היטב, דגירה 40 דקות על הקרח.
4. לשטוף נחקר חרוזים ב 1.5-מ"ל צינורות פעמיים בתוך מאגר 1.0 קר כקרח FCM מ"ל, centrifuging ב g 20,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לאחר כל שטיפה. בעדינות להסיר את supernatant אחרי כל שטיפה, נזהרת שלא להפריע את החרוזים. עבור צלחת ארובה התחתונה, לשטוף פעמיים עם 0.2 מ"ל קר כקרח הצפת FCM, centrifuging ב 1000g במשך 5 דקות ב 4 ° C אחרי כל שטיפה. Pipettor רב שימושית בשלב זה. כדי להסיר supernatant מן החרוזים בצלחת ארובה התחתונה, "קפיצי" הצלחת פעם אחת, ואז, בעודו הפוך, כתם כל נוטף מקצות את הבארות. נפח שיורית היטב כל, המכיל את החרוזים, יהיה כ - 20 μL.
5. Resuspend את החרוזים הצפת 200 FCM μL לדגימה. העברה צינורות FACS שכותרתו. דוגמאות מוכנים כעת עבור FCM.

4. FCM רכישה

חרוזים CML המתואר בפרוטוקול זה 3-5 מיקרומטר קוטר, כמחצית קוטר של לימפוציטים עכבר שקט. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את פיזור ידני קדימה (FSC) לזכות המגבר ואת פיזור לוואי (SSC) מתח כדי האוכלוסייה של אירועים חרוז לרשום על סולם. חרוזים IP הפרט צריך להקים האוכלוסייה באשכולות הדוקה אחת. הגדרות והשער צריך להיות כוללים כפילויות חרוז ופסולת.

1. לפני חרוזים ריצה או סטנדרטים חרוז, להסיר את הבלימה אגל שרוול העוטף את כניסת מדגם על cytometers כמה. אפשר נוזל נדן לטפטף בין הדגימות, כמו זו תנקה את כניסת ולמנוע חרוזים מלהיות נישא על מדגם אחד למשנהו.
2. השתמש חרוזים ללא תווית, פקד השליליות של הקרינה, וחלקיקים Rainbow כיול (RCPs), שליטה חיובית של הקרינה, כדי להתאים את ההגדרות כך ששני הקצוות הקרינה שלילי וחיובי להופיע בו זמנית על ציר ה-x יומן בקנה מידה. הדבר מבטיח כי הקרינה מן דגימות הניסוי יהיה גם על הסולם. שים לב RCPs הם קטנים יותר מאשר את החרוזים CML, כך FSC ופרמטרים SSC, כמו גם עמדת השער, ייתכן שיהיה צורך לשנות באופן זמני עבור מדגם זה.
3. חזור ללא תווית, חרוז הגדרות כיול פעם עם RCPs תושלם. אם רק אחד פלורסנט בדיקה לדגימה משמש, שום פיצוי הקרינה הוא הכרחי. באופן כללי, אנו בדיקה מתחמי multiprotein עם אחד fluorochrome-מצומדות MAB לדגימה FCM, ואנחנו בוחנים שותפים אינטראקציה מרובים מכתים דגימות חרוז במקביל מבז ספציפית עבור יחידות משנה שונות.
4. רוכשת ולשמור הקרינה קבצי הנתונים. ניתוח יכול להתבצע באמצעות זרימת cytometry תוכנה כגון CellQuest, FlowJo, או CFlow.

5. נציג תוצאות

באיור 1. IP-FCM מורכבים TCR/CD3 multiprotein. בתאי T מהלחץ עכבר BALB / c היו lysed digitonin ב 1%, ואת lysate היה נתון IP-FCM באמצעות אנטי CD3ε חרוזים. מתחמי שנתפסו הכילו כמויות משמעותיות של TCR-β (אזור סגול) ושיתוף הקשורים CD3-ε (ירוק), אך קרוב לרמות הרקע (שהוגדר על ידי החללית אימונוגלובולינים רלוונטי, ורוד זכר) של חלבונים אחרים כגון Thy1.2, CD45, או H-2K (ד) (חום, כתום, כחול עקבות, בהתאמה). ראה תוצאות דומות שפורסמו בעבר ^1-6.

Discussion

מידע על חלבונים אינטראקציות רלוונטי במיוחד בניתוח של תהליכים תאיים רבים כגון התמרה האות, התבגרות השושלת, תא מחזור התקדמות, ומפלים אפופטוזיס. IP-FCM מספק דרך מהירה, כמותית, ורגיש כדי לבחון את האינטראקציה של חלבונים להגדיר חברי מתחמי multiprotein ב קונפורמציה האם שלהם. יכול להיות בשילוב חרוזים ו מודגרות עם lysates תא יום אחד יכול להיות נחקר ונותחו למחרת. תבנית 96, גם צלחת מאפשר מספר גדול של דגימות כדי להיות מנותח בו זמנית כדי לספק יעילות איסוף נתונים למטרות סטטיסטיות או ההקרנה. שימוש בסטנדרטים חרוז ניאון, מספר חלבונים שנתפסו על ידי כל חרוז ניתן להעריך. מקור החומר מעט מאוד צורך ללכוד זיהוי, כך דגימות מוגבל analytes נדיר עדיין יכול להיות מנותח עבור אינטראקציות מרובות. למרות IP-FCM אינו מחייב הנדסה גנטית, epitope תיוג, denaturation, או חוץ גופית ערבוב של חלבונים בסביבה לא פיזיולוגיים, זה יכול להיות יחד עם אלה וטכניקות אחרות, מה שהופך אותו כלי רב ערך ונגיש עם תחולה ל מערכות ביולוגיות רבות.

פתרון בעיות:

רבים IP-FCM ניסויים ליצור אינטראקציה מועילה נתונים חלבון הפעם הראשונה שהם ניסו. עם זאת, אופטימיזציה של FCM-IP יכולה לשפר נטיה נוגדנים חרוזים, ללכוד חלבון מורכב, מחייב בדיקה ניאון.

היעילות של נטיה נוגדן ה-IP ניתן לקבוע על ידי חיטוט בשילוב חרוזים ישירות עם נוגדנים נגד אימונוגלובולינים. אם יעילות זו היא נמוכה, להגדיל את הריכוז של נוגדנים במהלך התגובה צימוד יכולים להרשות נוגדנים IP יותר לצרף כל חרוז. זה יכול להגדיל את קיבולת המחייב של אצווה חרוז IP, וכתוצאה מכך ללכוד זיהוי משופרת של analytes. אחרים ראשוני אמין מולקולות המכילות (למשל טריס, שור אלבומין) לא צריך להיות נוכח במהלך התגובה צימוד, כמו אלה יכולים להתחרות עבור MAB מצורף חרוז לגרום צימוד נמוך מב. אם נטיה של MAB כדי חרוזים מוכיח בעייתית מסיבות אחרות, חרוזים יכול להיות במקום מצמידים את avidin / streptavidin, ונוגדנים biotinylated יכול להיות לאחר מכן לא קוולנטית כבול המשמש immunprecipitation.

למרות נטיה נוגדן טוב, זיהוי ראשוני של הקרינה חרוז הקשורים עלולה להיות נמוכה. לכידת ראשית, מורכב כשלעצמו עשוי להיות נמוך. מכיוון IP-FCM תלויה בריכוז של analytes, להגדיל את מספר התאים lysed לכל יחידת נפח תמוגה יכולים להגדיל ללכוד זיהוי אנליטי ו. בנוסף, ללכוד יכול להיות משופרת על ידי הפחתת מספר חרוזים IP מודגרות עם lysate, אשר מפיצה את מתחמי שנתפסו ברחבי חרוזים פחות, וכתוצאה מכך הקרינה הממוצעת עלתה ל חרוז כאשר נחקר. שנית, יתכן כי גישה של הנוגדן בדיקה של מתחמי שנתפסו מתעכבת sterically על ידי הנוגדן immunoprecipitating. במקרה זה, הבעיה ניתן לטפל באמצעות נוגדנים שונים כדי ללכוד ו / או בדיקה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free)	Reagent	Interfacial Dynamics	2-5000	Store at 4°C.
Rainbow Calibration Particles	Reagent	Spherotech, Inc.	RCP-30-5A	Store at 4°C.
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)	Reagent	Sigma-Aldrich	M-5287
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)	Reagent	Sigma-Aldrich	22980 E-6383	Store at -20°C under desiccating conditions.
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin	Reagent	Sigma-Aldrich	P-2714	Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves.
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney	Reagent	Fisher Scientific	08-408-230	For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining