En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Resumen

Ortotópico modelos animales de cáncer de ovario reproducir mejor las enfermedades humanas y por lo tanto, mejorar nuestra comprensión de la progresión del cáncer y la respuesta del tumor a la terapia. Un modelo de ratón recibe una inyección intrabursal de luciferasa que expresan las células tumorales de ovario. El tratamiento se administra a través de una sonda nasogástrica. El crecimiento del tumor está controlado por In vivo Sistema de imágenes.

Resumen

El cáncer humano y respuesta al tratamiento es mejor representados en los modelos animales ortotópico. Este trabajo describe el desarrollo de un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario, el tratamiento del cáncer a través de la administración oral de fármacos, y el seguimiento del comportamiento de las células tumorales en la respuesta al tratamiento farmacológico en tiempo real utilizando en el sistema de imágenes in vivo. En este modelo ortotópico, las células ováricas tumorales que expresan luciferasa se aplican por vía tópica mediante la inyección directamente en la bolsa del ratón, donde se encierra cada ovario. Tras la inyección de D-luciferina, un sustrato de luciferasa de luciérnaga, la luciferasa de células que expresan generar señales de bioluminiscencia. Esta señal es detectada por el sistema de imágenes en vivo y permite un medio no invasivo de la vigilancia del crecimiento del tumor, la distribución, y la regresión en los animales. La administración de fármacos a través de una sonda nasogástrica permite un volumen máximo de dosificación de 10 ml / kg de peso corporal que se entregarán directamente en el estómago y se asemeja mucho a la entrega de medicamentos en tratamientos clínicos. Por lo tanto, las técnicas aquí descritas, el desarrollo de un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario, la administración oral de fármacos, y de imágenes in vivo, son útiles para una mejor comprensión del cáncer de ovario humano y el tratamiento y mejorar la orientación de esta enfermedad.

Protocolo

I. Preparación de las células tumorales de ovario

1. Crecer líneas celulares de cáncer de ovario que expresan luciferasa en la cultura. Fuentes de la luciferasa se puede Firefly, Renilla, o de otras especies. Las células que expresan proteínas fluorescentes también se puede utilizar. Para esta demostración se utiliza un cáncer de ovario línea celular, OVCAR5, expresando luciferasa de luciérnaga.
2. Las células de la cosecha utilizando la técnica de rutina de cultivo celular.
3. Mantener la suspensión de células (10.000 células / l) en tampón fosfato salino (PBS) en hielo hasta el momento de la inyección.

II. Inyección intrabursal

Este procedimiento requiere la ayuda de una segunda persona. Todos los procedimientos quirúrgicos se llevan a cabo en condiciones asépticas. Esto incluye el uso de vestimenta quirúrgica y el uso de instrumentos quirúrgicos estériles, jeringas y agujas.

1. Prepare la solución anestésica mediante la mezcla de 3 ml de clorhidrato de ketamina (100 mg / ml), 1,6 ml de clorhidrato de xilazina (100 mg / ml), 1,5 ml de acepromacina (10 mg / ml) y 20 ml de cloruro sódico al 0,9%.
2. Compruebe el número de identificación del animal y la salud observable. Anestesiar al animal preparado ketamina-xilazina-acepromacina a través de la anestesia por vía intraperitoneal (ip) con un volumen de dosis de 8 ~ 9 ml / kg de peso corporal (PC).
3. Confirmar que el animal está bajo un claro aceptable de la anestesia mediante la realización de un sujetador con codo con pinzas o los dedos de las patas traseras del animal. Si no es reflejo de pedal, espere un profundo plano de la anestesia hasta que el animal no responde a este procedimiento.
4. Coloque la cara dorsal de los animales sobre una gasa estéril con la cabeza de espaldas y la cola hacia usted. El punto de incisión se encuentra a la izquierda oa la derecha de la línea media y por encima de los ovarios. Afeitarse o mojar la piel con alcohol al 70% en el punto de incisión.
5. Levante la piel humedecida con unas pinzas y hacer una pequeña incisión con la tijera en la posición dorsomedial y justo encima de la almohadilla de grasa de ovario. La almohadilla de grasa de ovario deben ser visibles por debajo de la superficie de la pared peritoneal. Almohadilla de grasa es fácilmente reconocible por su color blanco, en contraste con el tejido de color rosado oscuro que lo rodea.
6. Levante suavemente el revestimiento de la pared peritoneal y hacer una pequeña incisión como se describió anteriormente (5).
7. Coloque una almohadilla estéril gasa empapada en solución salina en la línea media al lado de la incisión. Ubique la almohadilla de grasa de ovario y tire de él y el resto que en la gasa. Estabilizar el ovario por la unión de la almohadilla de grasa con un clip de bulldog. Bajo un microscopio de disección, la posición del ovario como para permitir la inserción de la aguja (calibre 30, G) en la curva túbulo oviducto conduce a la bolsa. Cuando la aguja se inserta en la posición correcta, debe ser visible en la bolsa.
8. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa para inyectar 5 l de la suspensión celular entre la bolsa y el ovario, mientras que la jeringa se coloca al sitio de la inyección. Este paso requiere de dos personas. Una persona empuja el pistón, mientras que la otra persona mantiene la posición de la aguja. Retire la aguja rápidamente para sellar el sitio de la punción, pero con cuidado suficiente para no romper la bolsa y los túbulos. La bolsa debe aparecer ligeramente distendido con una correcta inyección.
9. Comunicado de la almohadilla de grasa de la pinza bulldog y suavemente reemplazar el aparato reproductor y la espalda almohadilla de grasa en la cavidad peritoneal. Cierre suavemente la pared del cuerpo tirando de la membrana peritoneal superior sobre el revestimiento inferior. Cerca de la piel con grapas quirúrgicas o grapas de heridas.
10. Colocar el animal recupera de nuevo en su jaula y proporcionar una fuente de calor segura para evitar la hipotermia y acelerar la recuperación. Monitor de la frecuencia respiratoria y la facilidad, el retorno del tono muscular y la capacidad de mover voluntariamente. Estos son buenos indicadores de la progresión hacia la recuperación. Grapas o clips de heridas pueden ser removidos de 7 o más días después de la cirugía.

III. La administración oral masiva

1. Use una aguja de 18 ~ 20 G sonda o tubo de alimentación con una punta redondeada. La aguja de sonda no debe ser mayor que la distancia desde la punta de la cabeza del animal a su última costilla.
2. Compruebe el número de los animales, la identificación y la salud observable. Suavemente pescuezo del animal sujetando la piel sobre los hombros con el pulgar y los dedos. La restricción debe ser sólo lo suficientemente firme como para los miembros anteriores que se extiende a cada lado y fuera del camino. El animal no debe ser capaz de comprender a la aguja.
3. Tire suavemente la cabeza del animal con su dedo índice, formando una línea recta a través del cuello y el esófago. Apoyo para la espalda del animal con la parte interior del dedo pulgar.
4. Con suavidad y sin forzar, insertar la aguja sonda a ambos lados de la boca y la lengua. En un movimiento suave, la aguja debe pasar con el techo de la boca y el esófago. La gravedad debe guiar la aguja hacia abajo, sin encontrar resistencia. Si hay alguna resisce, retire la aguja y empiece de nuevo. Gag del animal y el reflejo de tragar puede ser activado durante la inserción. Sin embargo, no debe haber resistencia o jadeo del animal. Es importante asegurarse de que el animal vuelve a respirar cuando la aguja está en su lugar marcando el movimiento de la nariz y el pecho.
5. Empuje lentamente el émbolo de la jeringa para dispensar el volumen de la dosis.
6. Retire con cuidado la aguja por sonda nasogástrica en el mismo ángulo y la vía como la forma en que se inserta en el esófago.
7. Devolver el animal a la jaula y la respiración del monitor y el comportamiento de 5 a 10 minutos.

IV. Imágenes in vivo

Usamos las Ciencias de la pinza de vida para controlar el comportamiento de las células inyectadas en la cavidad de la bursa. Los experimentos con este sistema suelen tener un plazo de 4 a 16 semanas desde el momento de la implantación del tumor.

1. Prepare la solución de D-luciferina (sustrato de la luciferasa de luciérnaga) disolviendo 5 ~ 20 mg en 1 ml de PBS y filtrado a través de la membrana 0,22 micras para la esterilización.
2. Cargue la cámara de inducción mediante la activación de ambos el oxígeno y el gas isoflurano. Encienda el flujo de gas a la cámara de inducción solamente. La tasa de flujo de isoflurano se mantiene en un nivel bajo hasta que los animales están listos para ser fotografiado.
3. Compruebe el número de los animales, la identificación y la salud observable. Colocar el animal en la cámara de inducción cargado con gas isoflurano.
4. Quitar el animal de la cámara cuando el animal parece estar anestesiado. Entregar 200 l de solución de luciferina preparado a través de la inyección ip con 30 agujas G. Es importante registrar el momento de la inyección con el fin de mantener el tiempo constante entre la inyección de luciferina y un rendimiento de imagen en todo el estudio.
5. Coloque la parte posterior de los animales luciferina-se inyecta en la cámara de inducción.
6. Establecer el sistema de imágenes para la configuración adecuada. Asegúrese de inicializar el sistema antes de la adquisición de la imagen de los animales en primer lugar.
7. Cierre el flujo de gas a la cámara de inducción y encienda el flujo de gas a la cámara de imágenes.
8. Coloque el dorsal de los animales anestesiados o con la parte ventral hacia arriba. Asegúrese de colocar la nariz de los animales en un cono de la nariz para mantener la inducción de la anestesia adecuada. Asegúrese de que el animal está en el "punto de la red de intereses", según lo indicado por la iluminación de color verde.
9. Cierre la puerta de la cámara y obtener la imagen en el momento adecuado. El tiempo puede ser determinada por la cinética.
10. Quitar el animal de la cámara de imagen y colocarla de nuevo en su jaula. Monitorear la recuperación de los animales como se describe en "inyección bursa".

V. Los resultados representativos

Figura 1. Imágenes in vivo de células de tumor de ovario en un modelo murino ortotópico. OVCAR5 células que expresan luciferasa fueron inyectados intrabursally en el ovario derecho y la imagen en el tiempo. Las imágenes fueron tomadas 13 (izquierda), 17 (centro) y 22 (derecho) días después de la inyección, utilizando el espectro de IVIS sistema de imágenes. Lado dorsal se muestra en el panel superior y la parte ventral es en el panel inferior. Tenga en cuenta que la propagación de las células tumorales peritoneales 22 días después de la inyección.

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por animal de Atención Institucional Fox Chase Cancer Center y el empleo.

Discusión

El cáncer de ovario es la principal causa de muerte entre las malignidades ginecológicas ^1. La alta tasa de mortalidad de esta enfermedad es en gran parte debido a su diagnóstico tardío y la falta de métodos fiables de diagnóstico ^2. Además, la quimioterapia convencional a menudo se encuentra con quimiorresistencia y la recidiva del cáncer ^3. Por lo tanto, nuevas terapias se requiere para hacer frente eficazmente esta enfermedad. En el desarrollo de nuevas terapias dirigidas a cáncer de ovario humano, es fundamental para desarrollar un modelo animal representativo.

Un modelo animal ortotópico tiene ventajas sobre los modelos de xenoinjerto convencionales (por ejemplo, inyecciones subcutáneas o intraperitoneal de células tumorales) en que: 1) que reproduce el sitio primario de la formación de tumores, 2) que representa el sitio común de metástasis, y 3) que proporciona a las células tumorales interactuar con microambiente apropiado ^{4, 5, 6, 7, 8.} Los roedores tienen una membrana única la bolsa que rodea el ovario y se continua con el oviducto. Este singular anatomía de los roedores permite la inyección de células tumorales de ovario ortotópicamente. Intrabursally inyectaron células de tumor de ovario se comportan similar a la enfermedad humana, con lo cual cada vez mayor dentro de la membrana y la difusión de la bursa en la cavidad peritoneal del tumor a medida que avanza. La inyección de células que expresan establemente luciferasas o proteínas fluorescentes permite también el seguimiento de la conducta de las células tumorales en tiempo real. Bioluminiscentes y / o la tecnología de imágenes fluorescentes permite repetidamente las celdas de imagen del tumor durante un período prolongado de tiempo y el crecimiento del tumor estudio, la distribución, y la regresión en forma no invasiva ^{9, 10, 11.}

Al establecer el modelo ortotópico, es fundamental para eliminar rápidamente la aguja de la bolsa tras la inyección. Retirada brusca de los sellos de la aguja de punción y evita la fuga de las células inyectadas. Sin embargo, al mismo tiempo, el movimiento debe ser suave para no romper la bolsa. En caso de fuga durante la inyección, puede causar que las células de las semillas en el abdomen y potencialmente confundir el estudio, es decir, la eyaculación difusión fuera del ovario. En este caso, el animal específico debe ser registrada y seguido para el desarrollo de sitios múltiples tumores en el peritoneo, antes del tratamiento o, alternativamente, eliminados de los análisis posteriores. Antes de realizar una sonda nasogástrica, es fundamental para comprobar la longitud de la sonda de alimentación, midiendo desde la punta de la cabeza del animal a la última costilla. Es útil para marcar el tubo en la nariz del animal y no pasar el tubo más allá de esta marca. La inserción del tubo más allá de esta marca puede dar lugar a una perforación en el estómago. La determinación de la longitud del tubo es especialmente importante en los animales jóvenes o animales que pesen menos de 20 g. Tras la inserción de la aguja de una sonda por el esófago, no debe haber resistencia o lucha de los animales. Es importante no administrar la solución o suspensión demasiado rápido ya que esto puede conducir a reflujo y posteriormente entregar volumen de la dosis incorrecta, así como la adición de estrés para el animal. Para obtener unos resultados de imagen comparable de vez en cuando, es conveniente mantener el tiempo entre la inyección constante de sustrato de luciferasa y de imagen. El lapso de tiempo se puede determinar mediante la adopción de una serie de imágenes después de la inyección del sustrato y observar la cinética de las señales. Desarrollo de un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario, la administración oral de fármacos, y en vivo de imágenes son las técnicas necesarias para una mejor comprensión del desarrollo y propagación del cáncer de ovario y la evaluación de nuevos regímenes terapéuticos que en última instancia, puede mejorar los resultados de los pacientes con esta enfermedad mortal.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine Hydrochloride	Vedco, Inc.	Not Available
Xylazine Hydrochloride	Lloyd, Inc.	Not Available
Acepromazine	Vedco, Inc.	Not Available
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796