Descelularización y recelularización de hígados enteros

Resumen

Descelularización perfusión es una técnica novedosa para producir andamios todo hepática que conserva la composición del órgano de la matriz extracelular y la microarquitectura. Aquí, el método de preparación de andamios todo órgano con descelularización perfusión y posterior repoblación con hepatocitos se describe. Los injertos de hígado funcionales y trasplantables se pueden generar con esta técnica.

Resumen

El hígado es un órgano complejo que requiere una perfusión constante para el suministro de nutrientes y oxígeno y la eliminación de los residuos con el fin de sobrevivir a ^una. Los esfuerzos para recrear o simular la microestructura del hígado con motivos up approach utilizando ingeniería de tejidos y técnicas de microfabricación no han tenido éxito hasta ahora debido a este reto de diseño. Además, los biomateriales sintéticos usados ​​para crear los andamios para aplicaciones de ingeniería de los tejidos del hígado se han limitado en la inducción de la regeneración y reparación de tejidos en gran parte debido a la falta de motivos de células específicas de unión que podría inducir a las funciones de las células adecuadas ^2. Descelularizada tejidos nativos como los vasos sanguíneos y la piel ^{3 4} en el otro lado se han encontrado muchas aplicaciones en la ingeniería de tejidos, y han proporcionado una solución práctica a algunos de los desafíos. La ventaja de la matriz descelularizada nativos es que conserva, en cierta medida, la composición original, y la microestructura, por lo tanto, la mejora de la adhesión celular y la reorganización ^5.

En este trabajo se describen los métodos para realizar la perfusión-descelularización del hígado, de tal manera que un hígado intacto bioscaffold que conserva la estructura de los vasos sanguíneos principales se obtiene. Además, se describen los métodos para recellularize estas matrices biodegradables para adultos con hepatocitos primarios, la creación de un injerto de hígado que es funcional in vitro, y tiene el acceso de los buques necesarios para el trasplante de vivo.

Protocolo

1. Hígado descelularización

1. La cosecha de un hígado de rata con canalización de la vena portal y el uso del catéter de calibre 18. Salir de la inferior y la vena cava superior abierta. Mantener el órgano hidratado en tampón fosfato salino (PBS) en una placa de Petri de 10 cm.
2. Establecer un sistema de perfusión, que consiste en depósito de 8 litros, bomba peristáltica y una trampa de burbujas.
3. Llene el sistema de perfusión con solución salina de fosfato y que siga funcionando durante 10 minutos. Rellene PBS en una placa de Petri de 10 cm y reducir la velocidad de flujo de tampón fosfato salino a 1 mL / min.
4. Transferir cuidadosamente el hígado cosecha a una solución salina de fosfato llena de 10 cm placa de Petri.
5. Continuar con la perfusión PBS durante la noche.
6. Iniciar la perfusión con un 0,01% (w / v) de dodecilsulfato sódico (SDS) en agua destilada durante 5 minutos.
7. Perfundir con PBS durante 1 hora.
8. Repita los pasos 1,6 y 1,7 veces más tres aumentando el tiempo de perfusión de SDS a 10, 15 y 20 en cada momento.
9. Continuar la perfusión con un 0,01% (w / v) SDS durante 24 horas.
10. Continuar la perfusión con el 0,1% (w / v) SDS durante 24 horas.
11. Perfundir con un 0,2% (w / v) SDS durante 3 horas.
12. Perfundir con un 0,5% (w / v) SDS durante 3 horas.
13. Perfusión con agua destilada durante 15 minutos.
14. Perfundir con un 1% (w / v) de Triton X-100 en agua destilada durante 30 minutos para eliminar cualquier ácidos nucleicos obligado.
15. Para lavar el hígado descelularizada matriz (DLM), perfundir con PBS durante 2 horas.
16. Opcional: Resecar todos los lóbulos, excepto el lóbulo medio.
17. Guarde el DLM en una placa Petri limpia y sellada empapado en PBS a ⁴ º C hasta su utilización (Figura 1).
18. Para esterilizar el DLM: 1) Lave el DLM con PBS estéril que contiene 0,1% (v / v) de ácido peracético y el 4% (v / v) de etanol y se incuba durante 3 horas a ⁴ º C. 2) Lavar con PBS estéril 2 veces. 3) Lavar con PBS estéril que contiene 2% de penicilina-estreptomicina, gentamicina 10ug / ml y 2,5 ug / ml de anfotericina B. Guarde el hígado descelularizada en la misma solución a ⁴ º C hasta su utilización en experimentos recelularización.

2. Recelularización de descelularizada hígado Matrix

1. Establecer un sistema de perfusión, que consiste en una cámara de perfusión, la bomba peristáltica y una trampa de la burbuja en condiciones estériles. Llene el sistema de perfusión con 200 ml de medio de cultivo, por ejemplo, niveles altos de glucosa DMEM (Sigma), el 10% de suero fetal bovino (Hyclone,), 100 U ml ^-1 penicilina, y 100 mg mL ^-1 estreptomicina (Invitrogen).
2. Coloque la matriz del hígado descelularizada en la cámara de perfusión y conecte el DLM en el sistema de perfusión a través de la cánula de la vena porta, mientras que la bomba está funcionando a 5 mL / min para evitar la formación de burbujas de aire.
3. Permitir la perfusión del medio a través del DLM durante 30 minutos.
4. Aislar hepatocitos primarios de una rata adulta con al menos 90% de viabilidad.
5. Detener el flujo en el sistema de perfusión e inyecte lentamente 50 millones hepatocitos (en 1-3 ml de medio de cultivo) en el sistema de perfusión a través de la trampa de burbujas.
6. Iniciar el flujo de 10 mL / min y recircular el medio durante 10 minutos.
7. Repita los pasos 2,5 y 2,6 hasta un total de 200 millones de células se introducen en el DLM (Figura 2) ^6.
8. Una vez que todas las células son perfundidos en el DLM, recoger la perfusión en cuatro tubos de centrifugación de 50 ml y centrifugar a 600 rpm durante 10 minutos. Descartar el sobrenadante y recoger las pastillas en un solo tubo. Determinar el número de células y la viabilidad a través de la exclusión azul tripán para determinar la eficiencia de la siembra.

3. Cultivo in vitro del injerto hepático Recellularized

1. Establecer un sistema de perfusión, que consiste en una cámara de perfusión, bombas peristálticas, oxigenador y una trampa de la burbuja en condiciones estériles (Figura 3). Llene el sistema de perfusión con 50 ml de medio de cultivo, por ejemplo, E Williams (Sigma), el 5% de suero fetal bovino (Hyclone,), 0,5 U ml ^-1 de insulina (Eli Lilly), 20 ng ml ^-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng ml ^-1 glucagón (Bedford Laboratories), 7,5 mg ml ^-1 de hidrocortisona (Pharmacia), 100 U ml ^-1 penicilina, y 100 mg mL ^-1 estreptomicina (Invitrogen).
2. Coloque el injerto hepático recellularized en la cámara de perfusión y conecte el DLM en el sistema de perfusión a través de la cánula de la vena porta, mientras que la bomba está funcionando a 5 mL / min para evitar la formación de burbujas de aire.
3. Asépticamente cerrar la cámara de perfusión y sella herméticamente para evitar cualquier fuga durante el cultivo.
4. Transferir el sistema de perfusión a una incubadora que es de 37 ^º C y tiene _10% de CO2 y aumentar el caudal de perfusión a 15 ml / min.
5. Conecte el oxigenador a un CO 95% O ₂ y el 5% ₂ tanques de mezcla de gas y establecer el caudal de gas de 0,5 litros / min. Esto debe alcanzar una presión parcial de oxígeno de aproximacióntely 400 mmHg.
6. El cultivo puede continuar hasta por 10 días con cambios diarios de medio de cultivo. El medio de cultivo pueden ser incluidos en la muestra todos los días para el monitoreo de las funciones del hígado del injerto como la urea albúmina, y la secreción de ácidos biliares totales. Al final del período de cultivo, el injerto hepático recellularized pueden tomarse muestras para análisis moleculares e histológicos.

4. Los resultados representativos:

La descelularización completa de un hígado de la rata lleva alrededor de 72 horas utilizando el protocolo descrito. La matriz resultante conserva el 100% del colágeno fibrilar, el 50% de los glicosaminoglicanos y sólo el 5% del ADN del hígado nativo (Tabla 1) ^6. La estructura vascular de la matriz se conserva como se evidencia por la corrosión de fundición y de exploración análisis de microscopía electrónica (Figura 4) ^6. La presencia de la microarquitectura vascular en el DLM facilita su repoblación con células con una eficiencia del 96% y su posterior perfusión para el cultivo in vitro. El injerto hepático recellularized se puede cultivar hasta 10 días in vitro y muestra las funciones propias del hígado como se confirma a través de la urea albúmina, y la secreción de ácidos biliares totales (Figura 5) ^6.

Figura 1. Descelularizada matriz de hígado al final del proceso de descelularización. (A) todo el hígado (b) el lóbulo medio después de la resección.

Figura 2. Representación esquemática de la recelularización del DLM.

Figura 3. Perfusión configuración del sistema para el cultivo in vitro del injerto hepático recellularized.

Figura 4. La estructura microvascular es retenido en la matriz del hígado descelularizada. Imágenes de la corrosión elenco de a) un hígado normal b) un hígado descelularizada, portal (rojo) y venas (azul) vasculatura. La digitalización de imágenes de microscopía electrónica de la c DLM) un buque, d) una sección con las vías biliares, como los vasos pequeños (flechas), barras de escala (a, b) 5 mm (c, d) 20 micras.

Figura 5. Funciones específicas del hígado del injerto hepático recellularized durante la perfusión de la cultura in vitro. una secreción) albúmina (p = 0,5249), b) la producción de urea (p = 0,5271) y c) la secreción de ácidos biliares totales (p = 0,0114). El análisis estadístico de la diferencia entre el experimento y el control se llevó a cabo durante el período de la cultura 10 días por el test de Friedman a = 0.01. Las barras de error representan el SEM (n = 3).

	Fresco Livera	Descelularizada hígado una matriz	los valores de p	% De hígado fresco
	n = 4	n = 8
Colágeno	0,07 ± 0,01	0,08 ± 0,03	0.56	114%
(Mg por g de hígado)
Glicosaminoglicanos	73,1 ± 6,7	34,2 ± 2,9	0.004	47%
(Mg por g de hígado)
ADN	14,9 ± 5,6	0,44 ± 0,08	3.3 10 -5	2,9%
(Mg por g de hígado)

Tabla 1. La composición bioquímica de la matriz de hígado descelularizada en comparación con el hígado nativo.
^{a Los} valores se representan como media ± sem

Discusión

El método descrito aquí descelularización perfusión produce un conjunto de andamios que el hígado tiene la misma estructura bruta y la microarquitectura vascular del hígado nativo. El andamio tiene una composición de la matriz extracelular similar a la del hígado nativo. El método recelularización logra la repoblación de los andamios con células de alta eficiencia y las células permanecen viables y funcionales durante el período de cultivo in vitro de la prueba. Con la adición de las cé...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149