Bioimagen registradas de Nanomateriales para el Monitoreo de Diagnóstico y Terapéutica

Resumen

Los métodos utilizados para evaluar Bioimagen biodistribución de células de las nanopartículas son aplicables para el seguimiento terapéutico y de diagnóstico de los compuestos nanoformulated. Los métodos descritos en este documento son sensibles y específicos cuando se evaluó por corregistro histológico. Las metodologías de proporcionar una vía de traslación de los roedores a aplicaciones humanas.

Resumen

Nanomedications puede ser transportado por la sangre a cargo de monocitos-macrófagos en el sistema retículo endotelial (RES, el bazo, el hígado, los ganglios linfáticos) y poner fin a los órganos. Estos últimos incluyen el pulmón, RES, y en el cerebro y funcionan durante el virus de inmunodeficiencia humana uno (VIH-1) la infección. Entrada de macrófagos en los tejidos es notable en las áreas de la replicación del VIH-1 de replicación y los sitios de inflamación. Con el fin de evaluar el potencial de los macrófagos como nanotransportadores, superparamagnéticas de óxido de hierro y / o drogas partículas cargadas recubiertos con tensoactivos fueron inyectados por vía parenteral en el VIH-1 ratones encefalitis. Esto se hizo para evaluar cuantitativamente las partículas y biodistribución de drogas. La resonancia magnética (MRI) los resultados de la prueba fueron validados por corregistro histológico y procesamiento de imagen mejorado. Final de la enfermedad de órganos como lo ejemplifica la histología cerebral alterada fueron evaluados por resonancia magnética. La demostración de la migración robusta de nanoformulations en las áreas de la encefalitis focal proporciona "prueba de concepto" para el uso de técnicas avanzadas de bioimagen para controlar la migración de macrófagos. Es importante destacar que las aberraciones histopatológicos en el cerebro se correlaciona con los parámetros de la toma bioimagen la utilidad general de la RM en el estudio de la distribución de células viables en la enfermedad. Postulamos que el uso de estos métodos puede proporcionar un índice de tiempo real de carga de la enfermedad y la eficacia terapéutica con el potencial traslación a los seres humanos.

Protocolo

1. Introducción

La entrega selectiva de fármacos y macromoléculas terapéutica (péptidos, proteínas y ácidos nucleicos) a los sitios de células y tejidos de la enfermedad activa y las infecciones microbianas en curso mejorará las respuestas farmacéutica durante la enfermedad ^1-3. Un sitio celular en particular es el macrófago que es altamente móvil e inmune atractivo y es un objetivo constante principales del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). ⁴ Es importante destacar que la inflamación los macrófagos participan también subyace una amplia gama de trastornos que incluyen degenerativas, infecciosas inflamatorias, y las enfermedades cancerosas, y la movilidad de la célula para la enfermedad de los sitios de la progresión subyacente de las lesiones de tejidos ^5-9. Es importante destacar que el uso de los macrófagos transmitidos por la sangre de drogas, macromolécula, y los portadores de la señal ha ganado recientemente la atención por su potencial traslación. Sin embargo, una obstrucción significativa en el logro de los potenciales terapéuticos es la barrera hematoencefálica (BBB), entre las barreras de otros tejidos que son impermeables a un amplio espectro de las macromoléculas y las proteínas. Estas barreras, sin embargo, no permitir el paso de la célula. En conjunto, se prevé que en el curso natural de los macrófagos enfermedad periférica que las barreras de derivación puede llevar a los medicamentos formulados, los marcadores y los péptidos a los sitios de infección o inflamación. Sin embargo, estas tecnologías siguen siendo sólo en el desarrollo. Es a través de nuestras obras, que mediada por células de entrega puede ser desarrollado para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas y aplicaciones son compatibles con modelos animales y en laboratorio de las enfermedades humanas ^10-12.

2. Preparación de nanomateriales

Preparación de nanomateriales para la administración de fármacos y estudios de biodistribución es el tema de un manuscrito paralelo en este tema (manuscrito de referencia en paralelo). Todos los procedimientos para la fabricación de nanopartículas cristalinas se llevan a cabo en una campana de flujo laminar. Todas las superficies son desinfectadas antes de su uso con alcohol al 70%. Esto incluye la superficie de trabajo, el exterior de los guantes y los derrames de cualquier. Todos están cubiertos con una solución de alcohol al 70% replicar inmediatamente con trapos. Los guantes se descartan después de su uso y no usar al entrar en cualquier área de laboratorio. Excipiente de medicamentos, agua estéril con / reactivos que contienen cualquier / todo para la fabricación de drogas cargado de partículas sólo se pone en las áreas de trabajo cuando sea necesario para los procedimientos. Pipetas estériles envueltos sólo se utilizan y se desecha después de su uso en un contenedor de residuos biopeligrosos. El aparato dispuesto húmedo se desinfecta con alcohol antes y después de su uso. Área de trabajo se limpia inmediatamente antes y después con alcohol al 70%. Solución de nanopartículas es la prueba de pirógenos, de acuerdo con las directrices de la FDA para evaluar la ausencia de endotoxina bacteriana en soluciones de partículas medicamento que se usa para los animales. En pocas palabras,

1. Nanoformulations candidato para el uso in-vivo se replican mediante la sustitución de la base de drogas o las gotas con un tamaño de partícula idéntica o un trozo molido de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) antes de recubrir con el surfactante adecuado.
2. Esto es seguido por medidas de tamaño, costo, forma, y ​​la citotoxicidad para determinar si el modelo de sistema SPIO tiene las mismas propiedades que el fármaco candidato nanoformulated.
3. Por último, los ensayos de célula de carga se llevan a cabo mediante la incubación con el candidato nanoformultation modelo SPIO con el fin de determinar la capacidad de relajación dentro de las células con fantasmas compuesto de células marcadas en suspensión en gel de agar. Fantasmas son preparados por triplicado y se preparan a una serie de concentraciones con el fin de cuantificar la capacidad de relajación debido a la absorción de SPIO en las células. Esto proporciona un índice de sensibilidad y determina si el nanoformulations puede afectar el estado de oxidación, y por lo tanto la visibilidad de la SPIO en imágenes por resonancia magnética (MRI).

3. Métodos y procedimientos: Preparación de los animales

1. Inyecciones / catéteres. Dependiendo del tiempo de interés, las inyecciones pueden requerir el uso de un catéter para inyectar al animal dentro de la resonancia magnética. Los catéteres se preparan utilizando una aguja magnética y no una extensión de la tubería con un diámetro mínimo para reducir al mínimo el espacio muerto en la línea de inyección. El catéter debe ser precargadas, ya sea con la solución que contiene el nanomaterial que se inyecta o solución salina, dependiendo del espacio muerto y el volumen total aceptable de la inyección. Si es posible, la inyección se puede seguir con una solución salina fisiológica. Si los tiempos de aguda no son de extrema importancia, un análisis previo se puede realizar, y la inyección se puede hacer fuera del imán en un tiempo predeterminado antes de que el seguimiento de las exploraciones de las medidas de biodistribución. Los catéteres son por lo general se inserta en la vena de la cola para inyecciones intravenosas.
2. Anestesia y monitorización. Antes de la exploración, el animal es colocado en una cámara para inducir la anestesia. Esta cámara se rellena automáticamente con el isoflurano al 1,5% en el 70% nóxido de itrous y el oxígeno del 30% con el fin de acelerar el inicio de la anestesia en el animal y minimizar la cantidad de tiempo necesario para asegurar que el animal no se despierta después de la retirada de la cámara. Una vez que el animal esté totalmente anestesiado, el animal es retirado de la cámara y se coloca en el soporte estereotáctica equipado para vigilar la frecuencia respiratoria y la temperatura del animal y continuó proporcionando isoflurano durante la instalación y de escaneo.
3. Los titulares de los animales y consideraciones de ajuste: Set-up incluye lubricante ocular para proteger contra las úlceras corneales. El animal es ligeramente envuelto con gasa y la gasa se asegura en su lugar para reducir al mínimo la pérdida de calor durante la exploración y para proporcionar una presión positiva sobre el monitor de respiración. Los titulares de los animales están equipados con barras de diente ajustable, lo que permite la alineación vertical y horizontal de la cabeza. Esto es particularmente importante para el campo de alta resonancia, como la angulación de la cabeza en dirección caudal-rostral causará dificultades adicionales con la falta de homogeneidad del campo magnético debido a la susceptibilidad magnética. Falta de homogeneidad del campo magnético es perjudicial para la calidad de alta T ₂ * MRI, así como ^una espectroscopia por resonancia magnética H ⁽¹ H MRS) y la resonancia magnética por tensor de difusión (DTI). Además de la posición correcta del ángulo de la cabeza en dirección caudal-rostral, las rotaciones de la cabeza se debe evitar en la medida en que sea factible. Teniendo en cuenta la rotación de la titular de los animales en el imán indemnizar a las rotaciones de menor importancia, que puede ocurrir a partir de un animal a otro. Esto puede reducirse aún más la colocación cuidadosa de la cabeza y la atención a la angulación antes de colocar al animal en el sistema de resonancia magnética.
4. Calibración y Nivelación: Una vez que el animal está en el soporte y la bobina de la superficie está bien colocado en la cabeza, la posición inicial de que el animal está determinado por un tiempo real de una dimensión de lectura en la dirección caudal-rostral. La señal se limita a la zona alrededor de la bobina de superficie utilizada para la recepción, lo que limita la necesidad de una interpretación de las formas de onda observada. Una vez que la posición inicial se determina, una imagen de localizador en 3 planos se toma para determinar la posición exacta del animal en el escáner y para permitir el movimiento a la ubicación precisa que se requiere para la exploración (s) de interés. Esto es seguido por el ajuste de la homogeneidad del campo magnético o "cuñas" del imán. Esto se hace mediante la asignación de la distribución del campo y el cálculo de una corrección determinado con precisión espacial basado en las respuestas medidas de una serie de electroimanes o "rollos cuña" en el sistema diseñado para ajustar la homogeneidad de campo. Cuñas se lleva a cabo mediante una secuencia de eco de gradiente y de múltiples software de cartografía desarrollada por el Dr. Hetherington ^13. Regiones de la homogeneidad se adaptan a la región de estudio por cada método de imágenes individuales. Una vez que calce es completa, podemos adquirir la exploración (s) de interés por parte del animal.

4. Adquisición de Datos

1. T alta resolución _{de 2} * RM ponderada. Biodistribución de nanopartículas que contienen SPIO se puede determinar mediante la detección de las regiones de la pérdida de señal en alta resolución en 3D T ₂ * RM ponderada. La región del cerebro se determina a partir del análisis del localizador y prescritos en las imágenes localizador o exploraciones adicionales si es necesario. AT ₂ * exploración RM ponderada con una resolución de 150 micras isotrópico es adquirido. Un gradiente de alta resolución en 3D recordó eco resonancia magnética de la cabeza del ratón se realiza a través de 25 mm jaula bobina volumen con los parámetros de adquisición de tiempo de eco = 5 ms, el tiempo de repetición = 50 ms, el 30% de eco, ángulo de inclinación = 35 grados, los promedios = 2, campo de visión = 20 x 20 x 20 mm con una resolución de 128 x 128 x 128 (vóxel size = 150 x 150 x 150 m ^3), el tiempo de adquisición total = 30 min.
2. Difusión Tensor Imaging (DTI): imágenes de tensor de difusión son medidas cuantitativas de la dirección y la magnitud de la difusión de agua dentro de las células de los tejidos. Como resultado, la fase de la señal es extremadamente susceptible al movimiento, como los escáneres es sensible o "ponderado" para el movimiento de agua microscópicas. Como resultado de ello, las adquisiciones de disparo único se desean evitar desplazamientos de fase entre las adquisiciones de causar manchas de la señal, y gating respiratoria es requerida para evitar el movimiento bruto en la adquisición de señales. Por lo tanto, una enfermedad respiratoria cerrada spin-echo eco de la difusión ponderada de imagen planar (EPI) secuencia de RM se emplea. Una vez más, cuñas de la región de los análisis es muy importante, ya que fuera de resonancia efectos en la evolución de la señal provoca errores de registro de la frecuencia de la señal, y por lo tanto la posición, en el plano de la imagen. EPI parámetros de adquisición incluye 14 sectores, 200 de ancho de banda KHz, 96 x 96 en la adquisición del avión sin contenido de 256 x 256, y un grosor de corte de 0,5 mm. La codificación de la difusión se utilizó un esquema de equilibrio, la polaridad de rotación-invariante y alterna icosaédrica (12 direcnes) ^14,15. El esquema de codificación se ha diseñado para reducir el fondo de difusión de gradiente de acoplamiento ^16. Ponderación del factor de difusión b = 800 mm ^-2 s, δ = 4 ms, Δ = 15 ms, Gdmax = 40 g / cm, 200 ms de tiempo de subida, 7 promedios de b = 0 adquisición, tres promedios de cada b = 800 codificación dirección, por un tiempo total de adquisición de 20-40 minutos, dependiendo de la tasa de respiración.
3. Localizada ^una H espectroscopía por resonancia magnética (MRS ¹ H): ¹ H MRS se puede obtener de las regiones del cerebro prescrito en las imágenes obtenidas durante la sesión de imágenes mismas. Localizaciones anatómicas se encuentran en las imágenes para prescribir la región de interés para la adquisición de espectros. Una vez que la región se identifica, cuñas se realiza en una región correspondiente al volumen de compra, comprueba mediante un espectro de agua localizada. Entonces, el poder de la supresión de los pulsos de agua se han optimizado, la frecuencia se mide el agua para garantizar en la resonancia de la señal de agua, y una gama de ensayos breves que se adquiere para proporcionar control de calidad. Si los espectros son de calidad insuficiente, la configuración del sistema, como la radiofrecuencia (RF) y la configuración de cuña, se comprueban. Por último, si la calidad es aún insuficiente, un segundo en 3 planos localizador se ejecuta para asegurarse de que el animal no ha pasado de las exploraciones iniciales. En nuestra experiencia, esto proporciona un alto grado de reproducibilidad y precisión para la adquisición de espectroscopia. Finalmente, los espectros se adquieren en bloques cortos con el restablecimiento de la frecuencia del sistema entre las adquisiciones para eliminar los efectos de la deriva del campo magnético y para asegurar la reproducibilidad y la calidad de los análisis final. Al final de la adquisición, el espectro del pulso del agua de una en una ganancia del preamplificador predefinido se utiliza como referencia la señal de amplitud cuantitativa.
4. Histología y Blockface imagen: Después de la sesión de exploración de resonancia magnética en la última serie de tiempo de los experimentos, el ratón es irrigado, el cerebro se quita y se incrustan en un bloque de octubre, compuesto que se ha oscurecido con una gota de tinta china. El bloque se coloca en un criostato para cortar en rodajas y el análisis histológico. Blockface imágenes son adquiridas con una cámara digital (Canon EOS 300D Digital Rebel con una EFS Canon 60mm f/2.8 Macro ultrasónico USM) montado en la parte delantera del criostato con un soporte personalizado y activado por un interruptor remoto. Las imágenes digitales se adquieren cada 50 micrómetros a través del volumen del cerebro entero. Los sectores se numeran para permitir el registro en el volumen después del procesamiento histológico y la tinción. Cortes individuales blockface se han ajustado a la reconstrucción del volumen 3D utilizando el bloque de contornos para dar cuenta de fluctuaciones en la posición de la cabeza criostato. El volumen del cerebro es automáticamente utilizando el algoritmo de segmentación basado en la semilla que crece en la región el paquete de software Analizar (AnalyzeDirect, Lexena, KS).

5. Los análisis de datos

1. SPIO detección mediante resonancia magnética: SPIO causa la pérdida de señal _en T2 * RM ponderada; marcador y, como tal, el vacío señal de resonancia magnética es un tema delicado, pero no específica para detectar la presencia SPIO en el tejido. La sensibilidad depende de la resolución espacial de la resonancia magnética y el tamaño de la partícula SPIO, con una partícula sola micra de tamaño detectado con una resolución de 100 micras isotrópico. En estas obras, una resolución de 150 micras isotrópico con partículas de 200 nanómetros de tamaño SPIO se utilizan. Para proporcionar la sensibilidad y especificidad para detectar la presencia de SPIO en el cerebro, los ratones fueron examinados antes de la inyección de las células SPIO etiquetados para permitir que las imágenes de sustracción que se utilizarán para la identificación positiva de las células en el cerebro en momentos posteriores. 3D MRI se subimaged utilizando el método de nivel de conjunto limitado desarrollado en nuestro laboratorio, como se ha descrito previamente ^17. Subimaged volúmenes cerebrales fueron luego corregistradas, intensidad de la señal normalizada, y los volúmenes resta para detectar las regiones en el volumen cerebral con pérdida de señal (presencia de SPIO), que no fue a lo largo de los bordes para eliminar la falsa señal positiva de los errores de registro subpixel.
2. Corregistro de Histología y resonancia magnética: corregistro entre la histología y la resonancia magnética se llevó a cabo mediante el uso de la imagen blockface como una referencia común. Este enfoque reduce la complejidad del problema principal de la corrección de la contracción asimétrica de los cortes de tejido durante la preparación y la tinción de un problema de dos dimensiones como se describe en nuestros trabajos anteriores ^18,19. Aquí, la resonancia magnética y la detección de la histología de los macrófagos en el cerebro que contienen SPIO han demostrado una excelente correlación espacial, con una sobreestimación del volumen previsto por la pérdida de señal de resonancia magnética y una mayor sensibilidad a las células de algunos demostrada por histología ^12. Co-localización exacta de estas dos señales proporciona una medida de la exactitud de corregistro y deformaciones de la histología de vuelta a las formas originales de los cortes.
3. Región de interés (ROI) Análisis de DTI: DTI exploraciones suelen ser analizada por la selección de un retorno de la inversión anatómicas para determine las propiedades de difusión media de los tejidos en una subestructura anatómica particular.
   Los análisis de la difusión de datos ponderados se realizan mediante programas personalizados escritos en IDL (Interactive Data Language, ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO) como se describió anteriormente ^15,20. Análisis de mapas de las difusividades tensor (λ _1, λ _2, λ _3), la difusión media (D _av) donde: D _av = ₍₁ + λ λ λ ₂ + ₃₎ / ₃ y la anisotropía fraccional (FA), donde:
   
   Transversal (λ _⊥ = ₍₂ + λ λ ₃₎ / 2) y longitudinal (λ _ll = λ ₁₎ componentes del tensor de difusión se han obtenido como se describe en otro lugar ^21. Una vez que los mapas se construyen, ROIs se dibujan en T ₂ superpuestos RM ponderada con color codificado mapas λ direccionalidad _1. Ejemplos de las regiones elegidas para el análisis en el modelo de ratón del VIH se muestran en la Figura 1.
4. El análisis espectroscópico: La cuantificación de los compuestos metabólicos que contribuyen a los picos de cerebro MRS ¹ H se determina mediante una de una variedad de métodos de ajuste de la curva. Una variedad de técnicas de ajuste de curvas se han desarrollado. En nuestro laboratorio, contamos con un dominio del tiempo el método de ajuste (QUEST) ²² en el jMRUI ²³ paquete de procesamiento de señal que es una combinación lineal de los espectros de metabolitos individuales que contribuyen al espectro de final. Utilizamos una base establecida de 22 de metabolitos individuales como posibles factores contribuyentes. Los espectros base son simuladas y comprueba mediante los espectros de las soluciones de metabolitos individuales. Un ejemplo del resultado de ajuste de la curva de un solo espectro se muestra en la Figura 2.

6. Resultados representante

Ejemplos de DTI y 1HMRS se muestran en las figuras 1 y 2. Otros ejemplos de 1H MRS ^24-26 y ²⁷ DTI resultados se pueden ver en nuestras publicaciones anteriores. Ejemplos de preinyección T ₂ * RM ponderada con una superposición de la ubicación de las células marcadas en amarillo se muestra en la Figura 3. El ratón había etiquetado los monocitos macrófagos derivados inyecta en la vena de la cola. Cinco días después, T ₂ * RM ponderada fue adquirida y procesada como se describe más arriba. El ratón fue preparado por la inyección de los macrófagos infectados por VIH humanos en el cerebro, que es vista como una línea de los monocitos macrófagos derivados de ratones detectada. Otros ejemplos de tanto la detección de células marcadas y corregistro con histología se puede ver en nuestras publicaciones anteriores ^10,12.

Figura 1. Representación de las regiones analizadas para las métricas de DTI.

Figura 2. Ajuste espectroscópicas utilizando QUEST en la sala de procesamiento de señal jMRUI.

Figura 3. La detección de células SPIO marcado la migración de la sangre periférica en una región del cerebro con la encefalitis focal. Posiciones de la célula (amarillo) rebanadas representante de superposición de una T ₂ * adquisición de RM ponderada según se detalla en el texto.

Discusión

El registro exacto de la histología con resultados de las imágenes en vivo es un paso crítico en el desarrollo de biomarcadores de imagen para la detección y estadificación de la enfermedad neuronal. Algunos parámetros de imagen es probable que se correlaciona con graves cambios morfológicos que incluyen cambios en las propiedades de relajación magnética de los tejidos utilizados para detectar la presencia de la enfermedad de la materia blanca y el cáncer. Otros métodos más sutiles, como la DTI, son propensos a detectar cambios celulares tempranos que pueden no ser detectables, como los cambios histológicos causados ​​por la enfermedad no aparecen hasta después de las etapas de la enfermedad. Sin embargo, otros marcadores, como los marcadores de espectroscopia, pueden ser indicadores de los cambios precoces y reversibles, que precede incluso la más sutil de las alteraciones celulares.

Biodistribución se puede determinar de forma no invasiva utilizando una variedad de métodos. Los principales métodos no invasivos son la tomografía por emisión de positrones (PET), emisión de fotón único (SPECT), formación de imágenes ópticas y de resonancia magnética. Medicina nuclear basado en imagen (PET y SPECT) han sido utilizados durante los años de biodistribución muchos, pero estos métodos están limitados por la vida de la mitad de los radiotrazadores utilizados para el etiquetado de los compuestos o los nanomateriales, especialmente para los trazadores de PET. Imágenes ópticas se pueden utilizar para pequeños roedores, pero no puede ser traducido para el uso humano, excepto para las regiones de fácil acceso, como los tumores de la superficie debido a la absorción de la luz y la dispersión de la luz. Además, es difícil cuantificar las señales ópticas por las mismas razones. MRI utiliza etiquetas persistentes, tales como SPIO que pueden ser rastreados en el cuerpo durante un período de semanas. Esto, también, se debe utilizar con precaución, ya que la etiqueta se pueden transferir a las diferentes células o ser reabsorbido por el cuerpo.

Especificidad de la detección de SPIO en la RM pueden ser proporcionados por una variedad de métodos. Los métodos de detección, que proporcionan señales positivas como negativas, se utilizan para mejorar la especificidad de la RM para detectar la presencia de SPIO en el tejido. El método de sustracción utilizado en este trabajo ha sido utilizado por otros, así ^28. Otros enfoques incluyen la detección de la resonancia ^29-31, la fase de imágenes sensibles que produce un patrón en particular cerca de los huecos SPIO ^32, y cero en tiempo de eco de imagen que utiliza ponderación T1 para producir una intensidad de señal positiva en la región de SPIO ^33. El avance de estos métodos para mejorar la cuantificación de la etiqueta, la sensibilidad y la especificidad es un área de investigación activa en la actualidad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane
Medical Oxygen
Isoflurane vaporizer
Rodent gas anesthesia mask
MRI compatible Stereotactic head holder
Syringe
Polyethylene catheter tubing
Non-magnetic needle
Eye lubricant
Gauze
Tape
Perfusion media
OCT compound for embedding tissue
MRI system
Digital Camera
Tissue Sectioning Cryostat