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Method Article
ARN de interferencia se ha demostrado muy eficaz para analizar la función del gen en Drosophila El desarrollo traqueal. Un protocolo detallado utilizado por Jiang laboratorio para inyectar dsRNA en embriones de la mosca de la expresión génica caída se ilustra. Esta técnica tiene el potencial de genes de detección necesarios para el desarrollo de órganos y tejidos en Drosophila.
Una prueba genética es uno de los métodos más eficaces para obtener conocimientos en un proceso biológico complejo. Con los años muchas mejoras y herramientas para la manipulación genética se han convertido en disponibles en Drosophila 2. Poco después del descubrimiento inicial de Frie y Mello 3 ARN de doble cadena que puede ser utilizado para derribar la actividad de genes individuales en Caenorhabditis elegans, el ARN de interferencia (ARNi) ha demostrado proporcionar una poderosa aproximación genética inversa para analizar las funciones de genes en el desarrollo de Drosophila órgano 4, 5.
Muchos órganos, incluidos los de pulmón, riñón, hígado y sistema vascular, se componen de redes ramificadas tubular que transportan líquidos o gases vitales 6, 7. El análisis de la formación de Drosophila traqueal proporciona un excelente sistema modelo para estudiar la morfogénesis de otros órganos tubulares 8. El Berkeley Drosophila Genome Project ha revelado cientos de genes que se expresan en el sistema traqueal. Para estudiar el mecanismo molecular y celular de la formación del tubo, el reto es entender el papel de estos genes en el desarrollo de la tráquea. En este sentido, se describe un método detallado de dsRNA inyección en embriones de Drosophila para la expresión de genes individuales caída. Con éxito derribado dysfusion endógena (días) la expresión génica por inyección de dsRNA. Disfunción es una proteína bHLH-PAS expresa en las células de fusión traqueal, y se requiere para la rama traqueal fusión 9, 10. disfunción RNAi elimina completamente la expresión disfunción y dio lugar a defectos de fusión traqueal. Este método relativamente simple proporciona una herramienta para identificar los genes requried para tissure y desarrollo de los órganos de la Drosophila.
1. De recogida de embriones
2. Tirar la aguja
Hacen que las agujas de microinyección tirando tubos capilares. Nosotros usamos un extractor de aguja de precisión de instrumentos del mundo (modelo PUL-1). Las especificaciones extractor aguja programa son: calor: clase 1, el retraso 4.
3. Llenado de las agujas
La carga de back-agujas con la pipeta Eppendorf P20 equipada con puntas Eppendorf Microloader, normalmente la carga 1.5-2 dsRNA l
4. Quiebre de las agujas
5. Inyección
6. El análisis fenotípico
7. Los resultados representativos:
Un ejemplo de dsRNA derribar dysfusion (días) de genes en embriones Drosophlia se muestra en la Fig. 1. GFP-dsRNA embriones inyectados son el control negativo. Disfunción es un factor de transcripción bHLH PAS expresa en las células de fusión traqueal. GFP-dsRNA embriones inyectados mostrar fusión traqueal normal, y la proteína Dis está presente en las células de fusión (Figura 1). Por otro lado, la dis-dsRNA inyecta embriones muestran la fusión no poder, y las proteínas Dis no están presentes en las células de fusión (fig. 1B). Cuando se inyecta dsRNA embriones se desarrollan en estado larvario, las larvas disfunción dsRNA inyectados mostraron la fusión no poder (Fig.1D) en comparación con las buenas prácticas agrarias dsRNA control inyectados negativo (fig. 1C). Estos resultados mostraron eficaces tumbar de la expresión endógena del gen disfuncional por dsRNA inyección en embriones de Drosophila
Figura 1. Eliminación de la función de disfunción de la dis-RNAi revela traqueal fusión defects. Embriones blastodermo (w 1118) fueron inyectados con las buenas prácticas agrarias dsRNA (control negativo) o disfunción dsRNA y se analizaron para detectar defectos traqueal. (A) Fase 16 embriones inyectados con las buenas prácticas agrarias dsRNA y teñidas con α-Dis y MAb 2A12 que las manchas de la luz traqueal. Prominente que se muestra es el lateral del tronco, que se ha fundido. Las flechas apuntan a las células troncales de fusión lateral dis-positivo. (B) Etapa 16 embriones inyectados con disfunción dsRNA y teñidas con α-Dis y 2A12 MAb. El embrión mostró una falta de fusión lateral del tronco (el asterisco indica la ubicación normal de una fusión lateral del tronco en los embriones de control). No se observan células dis-positivos fueron observados, lo que indica que la dis-ARN supresión efectiva de proteínas Dis. (C y D) En segundo lugar, instar las larvas, ya sea con las buenas prácticas agrarias dsRNA o disfunción dsRNA fueron examinadas por microscopía de campo brillante para los defectos traqueal. (C) Sitios de la fusión se señalan con un asterisco en las buenas prácticas agrarias dsRNA larvas de control de inyección. (D) El lateral del tronco no se funden en las larvas de la dis-ARN inyectada, (*) indica la posición normal de una fusión lateral del tronco.
La inyección de dsRNA presente método permite aquí un análisis muy sensible y rápida de la función de genes en el desarrollo de Drosophila traqueal. Este método potencialmente puede ser aplicado para analizar la función de genes de otros tejidos y el desarrollo de órganos.
Los autores desean agradecer a la tripulación de Stephen dysfusion cDNA de anticuerpos, Dis y moscas w 1118.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
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