RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

Summary

התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד הגן תסיסנית פיתוח קנה הנשימה. פרוטוקול מפורט בשימוש על ידי ג'יאנג במעבדה להזריק dsRNA לעוברי לטוס ביטוי גנים מציאה מודגם. טכניקה זו יש פוטנציאל ההקרנה גנים הדרושים להתפתחות רקמות איבר תסיסנית.

Abstract

בדיקה גנטית היא אחת השיטות החזקות ביותר עבור השגת תובנות לתוך תהליך ביולוגיות מורכבות ^1. במהלך השנים שיפורים רבים וכלים מניפולציה גנטית הפכו זמינים תסיסנית ^2. זמן קצר לאחר הגילוי הראשוני על ידי Frie מלו ו ³ כי RNA גדילי כפול ניתן להשתמש מציאה את פעילותם של גנים בודדים Caenorhabditis elegans, התערבות RNA (RNAi) הוצגה כדי לספק גישה חזקה גנטית הפוכה לנתח פונקציות הגן בהתפתחות איבר תסיסנית ^{4, 5.}

איברים רבים, כולל ריאות, כליות, כבד, מערכת כלי הדם, מורכבים ברשתות צינורי מסועפת תחבורה חיוני נוזלים או גזים ^{6, 7.} ניתוח של היווצרות תסיסנית קנה הנשימה מספקת מערכת מודל מצוינת ללמוד את המורפוגנזה של איברים אחרים צינורי ^8. תסיסנית ברקלי פרויקט הגנום חשף מאות הגנים באים לידי ביטוי במערכת קנה הנשימה. כדי לחקור את המנגנון המולקולרי ו הסלולר של היווצרות צינור, האתגר הוא להבין את התפקידים של גנים אלה בהתפתחות קנה הנשימה. כאן, אנו תיאר שיטה מפורטת של dsRNA זריקה לתוך העובר תסיסנית כדי ביטוי גנים בודדים מציאה. אנחנו בהצלחה הפילו dysfusion אנדוגני (פרע) ביטוי גנים באמצעות זריקה dsRNA. פרע הוא חלבון bHLH-PAS לידי ביטוי בתאים היתוך קנה הנשימה, והוא נדרש ענף היתוך קנה הנשימה ^{9, 10.} פרע RNAi בוטלו לחלוטין הביטוי פרע וגרם פגם היתוך קנה הנשימה. שיטה זו פשוטה יחסית מספקת כלי לזיהוי גנים requried עבור tissure ופיתוח איבר תסיסנית.

Protocol

1. העובר אוסף

1. הגדרת כלובים של 25 ° C באמצעות 2-4 בן יומו w ¹¹¹⁸ מיץ צלחות flies.Grape משתנים בכל שעה במהלך היום כדי לסנכרן את איסוף ביצים במשך 1-2 ימים לפני איסוף
2. איסוף עוברים 1 שעות במהירות של 25 ° C
3. חותכים חתיכה מלבנית של אגר מיץ ענבים, לחתוך קלות בסכין גילוח באמצע, לעזוב את קו אגר
4. השתמש מכשיר מתכת העברת עוברים מהצלחת מיץ ענבים ליצירה שלך אגר מיץ ענבים, קו אותם בקו ישר עם ציר זמן של העובר בזווית של 45 מעלות לקו באמצע אגר. קבל קו ישר של כ 50 עוברים. ודא שכל נקודה עוברים באותו כיוון, עם קצה אחורי הצבעה מן השורה.
5. חותכים חתיכה מלבנית של נייר מקל כפול, ולמקם אותו להחליק כיסוי 18x18mm.
6. תרימי עוברים עם קלטת מקל כפולה על להחליק את מכסה
7. הנח את כיסוי להחליק להחליק כוס, יבש העובר באוויר במשך 10 דקות בערך.
8. מכסים את העובר בשכבה דקה של שמן 700 Halocarbon, עכשיו זה מוכן להזרקה.

2. משיכת המחט

הפוך את המחטים microinjection ידי משיכת צינורות זכוכית נימי. אנו משתמשים חולץ מחט מן העולם Precision Instrument (דגם PUL-1). חולץ מחט מפרטי התוכנית הם: חום: 1, עיכוב 4.

3. מילוי מחטים

חזור עומס מחטים באמצעות P20 Eppendorf פיפטה מצויד טיפים Eppendorf Microloader, בדרך כלל עומס 1.5-2 dsRNA μL

4. שוברים את מחטים

1. לפני שבירת מחט, במקום coverslip לשקופית.
2. הכן שקופית עם טיפה של שמן באמצע השקופית
3. הפעל את השלישי Picospritzer picopump להתאים את לחץ האוויר
4. לשבור את המחט מלא על קצה להחליק כיסוי, יצירת נקודה חדה.
5. כאשר קצה שבור, צעד על דוושת הרגל של Picospritzer III picopump, dsRNA כמה ידלפו מתוך קצה המחט.
6. קח את השקופית עם coverslip.
7. הכנס את מחט תחת טיפת שמן באמצע השקופית מוכן לפני.
8. התאם את ההגדרה על III Picospritzer picopump לקבל 100-200pl dsRNA כאשר צעד על דוושת רגל. dsRNA ניתן לראות טיפה קטנה.

5. הזרקה

1. תביאו את קצה המחט לחלק האחורי של העובר blastoderm הראשון לתוך המטוס מוקד ואותו מזריקים את העובר מחוץ למרכז סביב אורך 30-50 ביצה%.
2. לאחר שלב הרגל על ​​דוושת של III Picospritzer picopump, כמות קטנה של dsRNA יופיע כנקודה קטנה הזריקה.

6. פנוטיפי ניתוח

1. לאחר ההזרקה, במקום להחליק לתוך תא לחה מכוסה (פלסטיק צלחת פטרי) בשעה 18 ° C עד העוברים להתפתח לשלב העוברי הרצוי.
2. השתמש בדיקה כדי להסיר עוברים מהקלטת דו צדדי ולדחוק אותם אל קצה להחליק את המכסה.
   שטפו את העוברים את השקופית לתוך בקבוקון אוסף עם רשת ניילון בתחתית באמצעות heptane, לשטוף 3 פעמים עם PBT.
   עוברים Dechorionate ב אקונומיקה 50% עבור 5 דקות, לשטוף 3 פעמים עם PBT.
   העברת עוברים מבקבוקון את האוסף פיסת רשת ניילון, ולאחר מכן טובלים את רשת ניילון לתוך הפתרון מקבע (heptane 5 מ"ל, 4.5ml PBS, פורמלדהיד 0.5ml 37%) לשחרר את העוברים. תקן עוברים בפתרון מקבע עבור 30 דקות.
   Devitellinize עוברים עם מתנול, העברת עוברים אל צינור Eppendorf, ו immunostain את העוברים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
3. עוברים יכול גם להתפתח בשלב הזחל המתאים.
4. הכן שקופית עם טיפה של שמן Halocarbon 700 באמצע
5. העברה חד הזחלים לשקופית, לשים פתק לכסות על הדף
6. שימו לב הזחלים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.

7. נציג תוצאות:

דוגמה dsRNA להפיל (פרע) dysfusion הגן בעובר Drosophlia מוצג Fig1. GFP-dsRNA מוזרק הם עוברים בקרת שלילית. פרע הוא גורם שעתוק PAS bHLH לידי ביטוי בתאים היתוך קנה הנשימה. GFP-dsRNA עוברים מוזרק להראות היתוך קנה הנשימה נורמלי, חלבון פרע קיים בתאים היתוך (איור 1A). מצד שני, פרע dsRNA מוזרק עוברים להראות פיוז'ן בסניף נכשל, חלבונים פרע לא נמצאים בתאים היתוך (איור 1B). כאשר הזריקו dsRNA העוברים להתפתח בשלב הזחל, הזחלים פרע dsRNA מוזרק הראה היתוך סניף נכשל (Fig.1D) לעומת שליטה GFP-dsRNA שלילי מוזרק (תרשים 1C). תוצאות אלה הראו יעיל להפיל הביטוי פרע אנדוגני הגן על ידי dsRNA הזרקת לעוברי תסיסנית

באיור 1. הסרה של הפונקציה על ידי פרע פרע RNAi מגלה היתוך ד קנה הנשימהefects. עוברים Blastoderm (w ¹¹¹⁸⁾ הוזרקו או GFP-dsRNA (שליטה שלילי) או פרע dsRNA ו assayed פגמים קנה הנשימה. (א) 16 עובר שלב מוזרק עם GFP-dsRNA ומוכתמת עם α-פרע ו מב 2A12 כי כתמים לומן קנה הנשימה. בולט הוא הראה את תא המטען לרוחב, אשר התמזגו. הצבע על חצים לרוחב פרע חיובי תאים גזע היתוך. (ב) 16 עובר שלב מוזרק עם פרע dsRNA ומוכתמת עם α-פרע ו מב 2A12. העובר הראה חוסר איחוי תא המטען לרוחב (כוכבית מציינת את המיקום הרגיל של היתוך המטען לרוחב-בעוברים שליטה). פרע חיובי לא נצפו תאים, המעיד כי פרע RNA ביעילות בוטל חלבון פרע. (C ל-D) שניה instar הזחלים גם עם ה-GFP-dsRNA או פרע dsRNA נבדקו על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר פגמים קנה הנשימה. (ג) אתרים של היתוך מסומנים על ידי כוכבית ב-GFP הזחלים dsRNA לשלוט מוזרק. (ד) בתא המטען לרוחב לא הפתיל של הזחלים פרע RNA המוזרק, (*) מציין את המיקום הרגיל של היתוך גזע לרוחב.

Discussion

נוכח שיטת הזרקה dsRNA כאן מאפשר ניתוח רגיש מאוד מהיר של תפקוד הגן בהתפתחות תסיסנית קנה הנשימה. שיטה זו עלולה להיות מיושם לנתח תפקוד הגן רקמות אחרות ופיתוח איברים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Picospritzer III picopump	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
Micro-pipettes	Fisher Scientific	21170M
Microloaders	Eppendorf	930001007