Generación de plantas compuestas en Medicago truncatula Utilizado para los ensayos nodulación

Resumen

Se demuestra cómo las plantas peludas raíces compuesto puede ser utilizado para estudiar las interacciones planta-rizobio y la nodulación en las difíciles de transformar las especies Medicago truncatula.

Resumen

Al igual que en tumerfaciens Agrobacterium, rhizogenes puede transferir ADN extraño en células de las plantas sobre la base de las comunidades autónomas de raíz la inducción (Ri) del plásmido. A. rhizogenes puede causar la formación de raíces peludas en los tejidos vegetales y forma de las plantas compuestas después de la transformación. En estas plantas compuestas, algunas de las raíces regeneradas son transgénicos, llevando el tipo salvaje del T-ADN y el vector binario de ingeniería, mientras que los brotes siguen siendo los no transgénicos, que sirve para proporcionar energía y apoyar el crecimiento. Estas plantas de raíz compuesta peludo no productoras de semillas transgénicas, pero hay una serie de características importantes que hacen que estas plantas compuestos muy útiles en la investigación de las plantas. En primer lugar, con una amplia gama de huéspedes, A. rhizogenes puede transformar muchas especies de plantas, especialmente en las dicotiledóneas, lo que permite la ingeniería genética en una variedad de especies. En segundo lugar, A. rhizogenes infectar los tejidos y los explantes directamente, sin cultivos de tejidos antes de la transformación es necesaria para la obtención de plantas compuestas, lo que es ideal para la transformación de las especies recalcitrantes de la planta. Por otra parte, los tejidos transgénicos raíz se pueden generar en cuestión de semanas. De Medicago truncatula, podemos obtener las raíces de transgénicos en tan corto como tres semanas, más rápido de lo normal floral dip transformación de Arabidopsis. En general, la tecnología de raíces peludas planta compuesta es una herramienta versátil y útil para estudiar las funciones de genes y fenotipos relacionados con la raíz. Aquí se demuestra cómo las plantas peludas raíces compuesto puede ser utilizado para estudiar las interacciones planta-rizobio y la nodulación en el M. difíciles de transformar las especies truncatula.

Protocolo

El siguiente protocolo se ha utilizado para generar plantas peludas raíces compuesto en un modelo de leguminosas M. especies truncatula. Protocolos similares han sido adaptadas por lo menos ocho especies de plantas ^1-4. Se utilizó M. plantas truncatula peludas raíces compuesto para estudiar las funciones de genes en las raíces y el desarrollo de nódulos. El protocolo se divide en cuatro secciones: 1) la preparación de materiales vegetales, 2) la generación de las plantas peludas raíz compuesta, 3) la infección simbiótica Rhizobium, y 4) la identificación transgénicos raíz. Se utilizó el vector binario que contiene la proteína verde fluorescente (GFP) de genes como reportero para la detección de la raíz transgénica en las plantas de compuestos ^3. En comparación con los antibióticos basados ​​en la selección, las buenas prácticas agrarias basadas en detección es rápido, fácil y barata. En nuestra construcción, la ER-expresión optimizado gen gfp está impulsado por el promotor de la ubiquitina súper, que tiene fuertes señales de las buenas prácticas agrarias constitutiva en las raíces de transgénicos, que permite distinguir fácilmente entre las raíces de transgénicos y no transgénicos.

1. Preparación de materiales para plantas

1. M. truncautla semillas se obtienen de las plantas cultivadas en un invernadero (50% de humedad relativa, 16 / 8 h luz / oscuridad, 22/18 ° C día / noche la temperatura). Las semillas maduras se pueden almacenar a 4 ° C.
2. Aproximadamente 100 semillas son escarificadas en 10 ml de ácido sulfúrico concentrado (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) durante 10 minutos con agitación periódica.
3. Las semillas se lavan 5-7 veces con agua estéril con una suave agitación.
4. Las semillas se remojan en agua a temperatura ambiente durante 6 horas y se mantiene a 4 ° C durante 36-48 horas para sincronizar la germinación.
5. Aproximadamente el 20-30 semillas se extienden sobre papel de filtro húmedo, colocado en una placa de Petri. Se mantienen a 22 ° C, con 16 / 8 h luz / oscuridad ciclo, y 40 μmol.m ^-2. S ^-1 intensidad de la luz, durante 5-6 días.
6. Plántulas germinadas se transfieren en el suelo y se coloca en el invernadero durante un mes.

2. La generación de plantas peludas raíz Composite

1. Construcciones binarias portadores de genes de interés se convirtieron en A. rhizogenes utilizando protocolos estándar. Hemos diseñado un conjunto de vectores binarios que contienen el gen de la GFP como un marcador que facilitar la detección de los tejidos transgénicos. Estos vectores contienen varios promotores y todos tienen sitios de puerta de enlace de la clonación (Invitrogen, Carlsbad, CA) por la sobre-expresión o el silenciamiento de determinados genes ^3,5.
2. A. rhizogenes se cultivaron en medio LB 50 ml con la selección adecuada de antibióticos a 28 ° C durante 16-24 horas.
3. Las bacterias se recogen y se volvió a suspender a una concentración final de ₆₀₀ OD = 0,3 en una solución de la planta libre de nitrógeno nutriente (Tabla 1 y ^6).
4. Para apoyar la regeneración de las raíces peludas, una matriz de esterilización de apoyo ("lana de roca", Hummert Internacional, Earth City, MO) se corta en tacos de unos ³ cm 3. Ponemos 4 se conecta a una placa de Petri.
5. Un agujero se metió en la parte superior de cada tapón usando una pipeta de punta para facilitar la inserción de los explantes. A. rhizogenes (5 ml) se añade a cada enchufe.
6. Una sección de disparar con 2-3 yemas axilares se extirpa con un corte oblicuo. El explante se inserta en el enchufe, y ha crecido a 22 ° C durante unas tres semanas. Nos reservamos el explantes Medicago sin riego durante los primeros 10 días, entonces, el agua con 5 ml de nitrógeno libre de solución cuando sea necesario. Descubrieron que al eliminar el meristemo apical podría disminuir la formación de raíces adventicias.

3. Simbiótica Rhizobium (Sinorhizobium meliloti) Infección

1. Después de tres semanas, algunas raíces adventicias saldrá de la lana de roca. Las plantas de raíz compuesta peluda se transfieren a la arena o vermiculita (esterilizada), con o sin la lana de roca. Que se cultivan en el invernadero a 22 ° C, 16 / 8 h luz / oscuridad ciclo, y 300 μmol.m ^-2. S ^-1 intensidad de la luz durante una semana más.
2. Antes de rizobios infección, S. meliloti 1201 se cultivaron en 50 extracto de levadura-manitol ml de medio por 7 días a 30 ° C (Tabla 2 y ^6,7).
3. Resuspendidas las células rizobios se diluyen a una concentración final de ₆₀₀ OD = 0,08 con solución de nitrógeno libre de nutrición. Una suspensión fresca 10 ml de S. meliloti se aplicó a cada planta de compuestos para inducir la formación de nódulos.

4. Identificación de la raíz transgénica

1. Dos semanas después de la inoculación de rizobios, las plantas están compuestas arrancadas por el lavado en agua. Las raíces se pueden separar fácilmente de arena o perlita en el agua.
2. Ponemos las raíces peludos bajo un microscopio UV (Nikon SMZ1500, excitación 460-500nm, 505nm dicroicas, la barrera más 510 Nm). Las raíces transgénicas GFP positivos y las raíces adventicias son las buenas prácticas agrarias negativo. A continuación, recoger las raíces according la señal de las buenas prácticas agrarias, y contar el número de nódulos, medir la longitud de la raíz, y calcular la densidad de las raíces laterales. Las raíces de las buenas prácticas agrarias negativos son utilizados como control.

5. Representante de Resultados

En nuestro experimento, las raíces del pelo nuevo regeneradas a partir de los explantes en 2-3 semanas después de A. rhizogenes inoculación. Bajo el microscopio de rayos UV, las raíces transgénicas portadoras del gen GFP muestran una fuerte fluorescencia verde (Fig. 1). La cantidad de raíces regeneradas y la porción de las raíces de las buenas prácticas agrarias positivo dependerá de las condiciones de los explantes y el medio ambiente de crecimiento compuesta promedio plants.On, el 25% de las raíces se producen transgénicos raíces peludas ^3. Para aumentar la eficiencia de transformación, 1) la condena cubierta de plástico, como se muestra en el video, es suficiente para mantener la humedad en la bandeja de crecimiento para los primeros días, y las plantas sólo requieren poca agua en los primeros días. El riego excesivo es perjudicial para la formación de raíces peludas, 2) la concentración de inoculante Agrobacterium es importante para la transformación. Cantidad excesiva de las células no son útiles para la formación de raíces peludas o formación de nódulos. Para la formación de nódulos, la solución de las necesidades de riego que se libre de nitrógeno, de lo contrario, los nódulos de pocos formulario.

Las plantas de raíz compuesta peludos se pueden generar con los cotiledones o plántulas Entact como material de partida. Sólo modificaciones menores del protocolo anterior se ncessary para generar raíces peludas de otros tejidos ^8. Es importante destacar que cada raíz peluda es un evento de transformación independientes. Por lo tanto, los fenotipos observados en una planta de compuestos son la suma de eventos transforamtion varios que necesitan ser confirmados por las repeticiones en varias plantas compuestas

Figura 1. A. raíces transgénicas pueden ser resueltos a partir de raíces peludas. B. Los nódulos se formaron en las plantas de raíz compuesta peludo. Colocamos cuatro semanas de edad M. plantas truncatula peludas raíces en la UV-microscopio y las raíces GFP positivos pueden ser fácilmente identificados. (Flecha roja: La raíz de las buenas prácticas agrarias; Flecha amarilla: no GFP raíz)

Valores	g/200ml	ml de caldo / litro
MgSO 4 .7 H 2 O	12.3	2
CaCl2 .2 H 2 O	14.7	4
K 2 HPO 4 .3 H 2 O	6.8	1
K 2 SO 4	11	4
Fe Cl 3 .6 H 2 O	0.49	2.5
Micronutrientes	Ver más abajo	1

Micronutrientes	g por litro
H 3 BO 3	0.142
MnSO 4. H 2 O	0.077
ZnSO 4 .7 H 2 O	0,1725
CuSO 4 .5 H 2 O	0.037
NaMoO 4. H 2 O	0.024
CoCl 2. H 2 O	0,0025
NiSO4	0.001

Tabla 1. Nitogen sin solución de la nutrición

K 2 HPO4	0,5 g
NaCl	0,1 g
MgSO 4 · 7H 2 O	0,2 g
Extracto de levadura	0,4 g
Manitol	10g
pH = 6,8

Tabla 2. Medio de extracto de levadura manitol (por litro)

Discusión

La generación de raíces de las plantas compuestas peluda es un método rápido y fácil de obtener grandes cantidades de material transgénico para muchas especies de dicotiledóneas. Aunque este método no puede producir semillas transgénicas, se puede producir materiales transgénicos en unas pocas semanas. El método es especialmente adecuado para las plantas que tienen dificultades para establecer cultivos de tejidos o la generación de transformantes estables. Con los años, hemos utilizado esta tecnología para estudiar las funciones de genes, las funciones de promotor, los microARNs, las raíces y el desarrollo de las raíces laterales, la defensa y las respuestas de estrés abiótico, la nodulación y otros procesos simbióticos, las respuestas hormonales, perfil metabólico, el perfil de genes, el análisis proteómico, y otros procesos biológicos. El protocolo es robusto y replicable.