La criopreservación de embriones de preimplantación de ganado, ovejas y cabras

Resumen

Preimplantación de embriones criopreservados pueden ser después de la colocación en una solución hipertónica de crioprotectores a causa deshidratación celular. Después de equilibrio, la formación de cristales de hielo se induce en la solución que rodea al embrión. Una mayor deshidratación se produce cuando el embrión se enfría lentamente a temperaturas bajo cero antes de sumergirse en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Resumen

Preimplantación de embriones de ganado vacuno, ovejas y cabras pueden ser criopreservados para su almacenamiento a corto o largo plazo. Preimplantación de embriones consisten principalmente en agua, y evitar la formación intracelular de cristales de hielo durante el proceso de criopreservación es de suma importancia para mantener la viabilidad del embrión. Los embriones son colocados en una solución hipertónica (1,4 a 1,5 M) de un agente crioprotector (CPA) como el etilenglicol (EG) o glicerol (GLI) para crear un gradiente osmótico que facilita la deshidratación celular. Después de embriones alcanzar el equilibrio osmótico en la solución de APC, son individualmente cargado en la solución hipertónica CPA en pajuelas de 0,25 ml de plástico para congelar. Los embriones son colocados en un congelador velocidad controlada a una temperatura de -6 ° C. La formación de cristales de hielo se induce en la solución de CPA que rodea el embrión, y la cristalización provoca un aumento en la concentración de la CPA fuera del embrión, provocando una mayor deshidratación celular. Los embriones se enfría a una velocidad de 0,5 ° C / min, lo que permite una mayor deshidratación, a una temperatura de -34 ° C antes de ser sumergido en nitrógeno líquido (-196 ° C). Embriones congelados deben descongelarse antes de la transferencia a un receptor (sustituto) mujeres. Pajillas que contienen los embriones se retiran de la termo de nitrógeno líquido, que se celebró en el aire a temperatura ambiente durante 3 a 5 segundos, y se coloca en un baño de agua 37 ° C durante 25 a 30 segundos. Embriones criopreservados en GLI se colocan en una solución 1 M de sacarosa durante 10 minutos para la eliminación de la CPA antes de la transferencia a un receptor (sustituto) mujeres. Embriones congelados en EG, sin embargo, pueden ser directamente transferidos al útero de un destinatario.

Protocolo

1. Evaluar la idoneidad de embriones para la Criopreservación de ^un

1. Especímenes capturados en el tracto reproductivo de las hembras donantes individuales deben ser colocados en un medio isotónico embrión explotación durante 10 minutos antes de la evaluación mediante un microscopio estereoscópico. Esté seguro de mantener a los embriones de cada hembra donante separadas unas de otras para permitir la identificación de la paternidad de la descendencia de transferencia de embriones.
2. Utilizando magnificación baja (≤ 10 veces), las muestras de una hembra donante deben ser separados en grupos separados que consiste en óvulos no fertilizados, los embriones degenerados o embriones transferibles de calidad. Sólo el grado de calidad 1 o 2 embriones en la mórula compacta a través de etapas de desarrollo de blastocisto expandido son adecuados para la criopreservación, y todos los demás debe ser descartado (a menos que las mujeres sincrónica receptores están disponibles para la calidad de los embriones de grado 3 y una tasa de embarazo después de la transferencia de aproximadamente 25 30% se considera aceptable).
3. Inspeccione el grado de calidad 1 y 2 de mórula compacta mediante la ampliación de los embriones en estadio de blastocisto un aumento ≥ 50 veces para asegurarse de que la zona pelúcida del embrión está intacto y que no hay material (por ejemplo, las células, moco) que se adhiere a la zona pelúcida. Cualquier embrión con un roto o falta la zona pelúcida o con una zona pelúcida con material adherente debe estar separados de los otros embriones y, o bien ser desechados o procesados ​​por separado.

2. Los embriones de lavado para reducir la probabilidad de transmisión de la enfermedad ²

1. Mueva la zona pelúcida intacta embriones en un volumen mínimo de medio embrión isotónica explotación en el primer pocillo de medio de lavado de embriones (por ejemplo, solución salina de fosfato aumenta con antibióticos y suero bovino de albúmina sérica, ternero recién nacido, o alcohol de polivinilo). Mantener los embriones de cada hembra donante por separado, y no trate de lavar más de 10 embriones a la vez. Mueva los embriones en un volumen mínimo de medio en cada lavado sucesivos para alcanzar una serie de dilución ≥ 1:100, y estar seguro de utilizar estéril consejos sobre la manipulación de embriones que se cambian entre cada lavado sucesivos.
2. Mueva los embriones a través de 4 lavados más, como se indica en 2.1.
3. Si la transmisión de enfermedades virales es motivo de preocupación, lavado de embriones de dos veces en una solución de tripsina 0,25%, para un tiempo total de exposición combinada a la tripsina de no más de 90 segundos.
4. Después de los dos se lava la tripsina, lavado de embriones de 5 veces más en el medio de lavado de embriones como se describe en 2.1.
5. Después del lavado de embriones final, los embriones en lugar de embriones isotónica la celebración de mediano plazo.

3. Deshidratación embriones antes de la crioconservación ³

1. Los embriones deben ser transferidos en un volumen mínimo de medio isotónico la celebración de embrión en una solución hipertónica (1.4 a 1.5 Concentración molar) de un agente crioprotector (CPA), tales como etilenglicol o glicerol.
2. Permita que los embriones que se siente en medio de congelación (solución hipertónica CPA) hasta alcanzar el equilibrio osmótico. Debido a que el etilenglicol penetra las células embrionarias más rápidamente que el glicerol, tiempos de equilibrio son generalmente menos de embriones en etilenglicol (5 min) que en glicerol (10 min). Parte de este tiempo de equilibrio se puede lograr durante y después de los embriones se cargan en la paja (que se describe en el paso siguiente).

4. Los embriones de carga en una paja de 0,25 ml de plástico para la criopreservación

1. Conecte el extremo tapón de algodón de una pajita de plástico de 0,25 ml (11,5 cm de longitud de trabajo) a un dispositivo de carga de embriones, y aspirar aproximadamente 1,3 cm de solución hipertónica CPA en una paja debidamente etiquetados. Una variedad de procedimientos de etiquetado existe, incluyendo el uso de etiquetas impresas adscribirse a un tapón de paja o de otra paja conectados con un adaptador de paja.
2. Retire la paja de la solución de APC, y el aspirado de aproximadamente 0,15 cm de aire para crear una pequeña burbuja de aire dentro de la paja.
3. Aspirar un único embrión en alrededor de 0,8 cm de solución hipertónica CPA en la paja.
4. Retire la paja de la solución de CPA y el aspirado de aproximadamente 0,15 cm de aire para crear una segunda burbuja de aire diminutos dentro de la paja (burbujas de aire sirven para aislar físicamente el embrión dentro de la paja).
5. Aspirar aproximadamente 9,1 cm de la solución de APC para llenar completamente la paja, con la certeza de atraer un volumen suficiente de solución de APC para humedecer el cloruro de polivinilo (PVC) en polvo que existe en el extremo del enchufe de algodón de la paja. La solución CPA causa el polvo de PVC con gel y sellar el extremo de la paja.
6. Sellar el otro extremo de la paja con el polvo de PVC, plástico tapones de paja, o un cierre por calor.

5. La colocación de los embriones en una máquina de congelación de embriones velocidad controlada

1. Cualquiera de baño de metanol o congelación con nitrógeno líquido con máquinas de vapor puede ser programado para la crioconservación de embriones de preimplantación.
2. La carga de la paja que contiene la Embry os en una máquina de congelación, cuya temperatura se ha enfriado desde la temperatura ambiente hasta los -6 º C. Pajas de carga final de algodón tapar (a no ser de plástico tapones paja o adaptadores de paja se están utilizando, en la que el algodón caso extremo del enchufe se coloca hacia abajo).
3. Permita que los embriones que se siente a esta temperatura durante al menos 2 minutos antes de proceder.

6. Siembra

1. Una vez que los embriones se hayan enfriado a -6 ° C, utilice un par de pinzas de súper en nitrógeno líquido (o un palo con punta de algodón sumergida en nitrógeno líquido) para inducir la formación de cristales de hielo en la solución de CPA dentro de la paja al tocar las pinzas (o algodón palo con punta) en la columna de la solución por encima o por debajo del embrión.
2. El agua en la solución de APC se cristaliza en la región expuestos a nitrógeno líquido, y cristales de hielo se extienda a la columna de la solución de APC de inmediato que rodea al embrión.
3. Mantener los embriones en la siembra de temperatura durante 10 minutos antes de enfriamiento.

7. La deshidratación continua de embriones

1. Embriones frescos a una tasa de 0,5 ° C / min hasta una temperatura de -34 ° C. Esta velocidad de enfriamiento es importante asegurarse de deshidratación continua del embrión.
2. Mantener embriones a -34 ° C durante 10 minutos, antes de caer a los embriones en nitrógeno líquido (-196 ° C).
3. Lugar criopreservado embriones en una copa debidamente etiquetados (lleno de nitrógeno líquido) unido a una caña debidamente etiquetados, y colocar el bastón en un recipiente de un termo de nitrógeno líquido para su almacenamiento a corto o largo plazo.

8. Descongelar embriones criopreservados

1. Tire de la lata en el cuello del termo de nitrógeno líquido, asegurando que el recipiente se mantiene por debajo de la línea de hielo en el termo.
2. Localice la caña que contiene el embrión para ser descongelados, y rápidamente y retire con cuidado la paja de la copa, tener la certeza de que no se caliente otras pajas en la copa.
3. Sujete la paja en el aire durante 3-5 segundos (para reducir la incidencia de un agrietado zona pelúcida ^4), ​​y luego se sumergen en un baño de agua 37 ° C por un período adicional 25-30 segundos.
4. Quitar la paja del baño de agua, limpie la paja (con cuidado de no ensuciar la identificación de embriones en la paja), utilizar un dispositivo de corte de la paja para cortar el extremo del enchufe no sean de algodón de la paja (si es sellado con calor o con polvo de PVC ), o retirar con cuidado el tapón de cierre de plástico, y ya sea:
   1. carga de la paja en un dispositivo de transferencia de embriones y la transferencia lo antes posible a un destinatario embrión sincrónica (pero sólo si el embrión fue criopreservado con etilenglicol como la CPA), o
   2. Mantenga la parte de la paja sobre un plato que contiene una concentración de 1,0 molar de sacarosa (un compuesto no penetra), y el uso de un par de tijeras para cortar el extremo del enchufe de algodón de la paja. Contenido de la paja debe fluir libremente en la solución de sacarosa, sino a impulsar una pequeña columna de aire a través de la paja puede ser necesaria si ningún medio residual existe dentro de la paja. Permita que los embriones a permanecer en una solución de sacarosa durante 10 minutos, y luego se transfieren los embriones a embriones isotónica la celebración de medio durante 10 minutos. Evaluar embriones post-descongelación, la carga de paja en una nueva, y la transferencia a hembras receptoras adecuadas.

9. Los resultados representativos:

Una variedad de factores pueden influir en el embarazo y tasas de nacidos vivos como resultado de la transferencia de embriones de preimplantación congelados a hembras receptoras sincrónica ^5. Los embriones en etapas de desarrollo menos avanzado que el de mórula compacta o avanzado más de blastocisto expandido a menudo no sobreviven el proceso de criopreservación de embriones, así como en la mórula compacta y blastocisto temprano, blastocisto, y amplió las etapas del desarrollo embrionario de blastocisto. Embriones de calidad de grado 1 y 2 de mayor rendimiento deshielo post-las tasas de embarazo que la calidad de los embriones de grado 3 (que por lo general no son criopreservados, debido a la baja las tasas de embarazo después de la descongelación). Embriones mal manejo durante la congelación de embriones o el embrión descongelado procedimientos son propensos a exhibir tasas de reducción de embarazo. Embriones transferidos a hembras receptoras cuyos ciclos del estro no se han sincronizado con el de la hembra donante normalmente producen menores tasas de embarazos. Embriones producidos in vitro o manipulados de alguna forma (por ejemplo, una biopsia o dividida en dos) por lo general menor rendimiento tasas de embarazo. Bajo condiciones óptimas, las tasas de embarazo obtenidas luego de la transferencia de los congelados los embriones es típicamente un 60-70% en el ganado ^6,7, 65-75% en el ganado ovino ^8,9,10,11 y 60 a 70% en el ganado caprino ^12,13,14,15. Del mismo modo, las tasas de embarazo obtenidas luego de la transferencia de los congelados embriones producidos in vitro suele ser un 40-50% en el ganado ^6,16, 25-35% en el ganado ovino ^17, y 30-40% en las cabras ^{de 18 años.}

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Tabla 1. Esperado las tasas de embarazo después de la transferencia de embriones congelados de animales domésticos de las especies de rumiantes ganado a hembras receptoras sincrónica.

Discusión

Porque los embriones son, sobre todo de agua, es fundamental que los embriones de preimplantación adecuadamente deshidratado y se enfrió lentamente, de acuerdo con el protocolo descrito en este documento para evitar la formación de cristales de hielo intracelular. Una vez que el proceso de enfriamiento ha comenzado, es importante para mantener los cambios de temperatura y unidireccional para evitar las fluctuaciones de temperatura. Inicio de la formación de cristales de hielo ("siembra") a una temperatura adecuada para la solución específica del CPA es fundamental.

Las modificaciones a este enfriamiento lento / método rápido deshielo de la criopreservación de embriones de preimplantación incluyen el método de un solo paso (en la última columna del medio de carga en la paja es la sacarosa en lugar de solución CPA) ¹⁹ y el método de transferencia directa (cuando los embriones congelados en etilenglicol se descongelan y se transfieren directamente al útero de una hembra receptora sin quitar primero el glicol de etileno a partir del embrión) ^20. Para reducir el volumen de etilenglicol depositado en el útero de una transferencia directa (DT) mujeres destinatario, es recomendable llenar la paja de 0,25 ml con 6 cm de la celebración de medio antes de continuar como se describió anteriormente. Cabe señalar que existe una norma voluntaria dentro de la industria de transferencia de embriones comercial que preimplantación de embriones criopreservados para su DT deben ser congelados de color amarillo paja y se almacena en copas de color amarillo en el termo de nitrógeno líquido. El sector comercial también tiene requisitos específicos de etiquetado para todos los embriones congelados que se deben seguir.

Una alternativa a este método es la vitrificación de ^{21 años,} el método de no equilibrio de criopreservación, donde se enfría una mayor concentración (6.8 M) CPA solución ultra-rápidamente causando la solución APC para cambiar de estado líquido a una "vidriosa" estado sin hielo la formación de cristales. La vitrificación es probablemente más adecuado para la crioconservación de embriones que son menos avanzados que el desarrollo de mórula compacta debido a su sensibilidad a la temperatura aumenta.

Esta técnica tiene una aplicación para la conservación de los recursos de germoplasma ^22, así como a los internacionales de la industria comercial de la transferencia de embriones, donde más del 55% de los aproximadamente 500.000 preimplantación de embriones de bovino transferidos en el año calendario 2008 fueron criopreservados. ²³

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
BioLife medio de congelamiento	Agtech, Inc.	C18A C18,	1,5 M etilenglicol
Emcare etilenglicol congelación de la solución	ICPBio reproducción	IC8, IC10	1,5 M etilenglicol
Etileno glicol Vigro freeze plus	Bioniche Sanidad Animal	EVM835	1,5 M etilenglicol
Emcare 10% de glicerol solución de congelación	ICPBio reproducción	IC12	1,34 M de glicerol
Emcare 1 M sacarosa deshielo	ICPBio reproducción	IC16	1,0 M sacarosa
Vigro un paso deshielo	Bioniche Sanidad Animal	EVM247, EVM847	1,0 M sacarosa
Vigro deshielo 1-2-3 más	Bioniche Sanidad Animal	EVM248, EVM848	5%, 2,5%, 0% de glicerol con 0,5, 0,5, 0,6% de sacarosa
Emcare CSU descongelación kit	ICPBio reproducción	IC20	6%, 3%, 0% de glicerol con un 10,3% de sacarosa
BioLife tenencia y medio de transferencia	Agtech, Inc.	C15, C15A	modificado PBS con 0,4% de BSA (albúmina de suero bovino)
Emcare la celebración de una solución	ICPBio reproducción	IC2, IC4, IC6	0,4% de BSA (albúmina de suero bovino), MOPS buffer (zwitteriones inerte)
Vigro la celebración de más	Bioniche Sanidad Animal	EVM024, EVM824
Sosteniendo SYNGRO medio	Bioniche Sanidad Animal	ESM024, ESM224, ESM828	contiene ácido hialurónico, sin productos de origen animal
BioLife modificado D-PBS	Agtech, Inc.	C06	fosfato de Dulbecco modificado solución salina tamponada
BioLife BSA fracción V	Agtech, Inc.	B09	albúmina de suero bovino liofilizado, fracción V
BioLife antibiótico-antimicótico	Agtech, Inc.	B01	anfotericina B, penicilina G, sulfato de estreptomicina
BioLife tripsina kit	Agtech, Inc.	C22A	25 g de tripsina liofilizada, agua estéril, estéril D-PBS

Nombre del equipo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Biol-Cool congelador velocidad controlada	FTS Sistemas	BC-IV -40	Metanol congelador baño
Congelar el congelador de control velocidad controlada	Criológico	CL2200	Congelador de nitrógeno líquido