Cryoconservation d'embryons pré-implantatoire de bovins, ovins et caprins

Résumé

Embryons peuvent être cryoconservés préimplantatoire après le placement dans une solution hypertonique cryoprotecteurs pour provoquer une déshydratation cellulaire. Après équilibration, la formation de cristaux de glace est induite dans la solution environnante de l'embryon. Déshydratation survient plus que l'embryon est refroidi lentement à des températures inférieures à zéro avant de plonger dans l'azote liquide pour le stockage.

Résumé

Embryons pré-implantatoire des bovins, ovins et caprins peuvent être cryoconservés pour le stockage à court ou à long terme. Embryons pré-implantatoire sont constitués principalement de l'eau, et l'évitement de la formation de cristaux de glace intracellulaire pendant le processus de cryoconservation est d'une importance primordiale pour maintenir la viabilité des embryons. Les embryons sont placés dans une solution hypertonique (1,4 - 1,5 m) d'un agent cryoprotecteur (CPA), tels que l'éthylène glycol (EG) ou glycérol (glyc) pour créer un gradient osmotique qui facilite la déshydratation cellulaire. Après embryons atteindre l'équilibre osmotique dans la solution de l'ACP, ils sont individuellement chargés dans la solution hypertonique CPA dans 0,25 ml pailles en plastique pour la congélation. Les embryons sont placés dans un congélateur à vitesse contrôlée à une température de -6 ° C. La formation de cristaux de glace est induite dans la solution CPA entourant l'embryon, et la cristallisation entraîne une augmentation de la concentration de l'APC en dehors de l'embryon, entraînant une déshydratation encore cellulaire. Les embryons sont refroidis à un taux de 0,5 ° C / min, ce qui permet encore la déshydratation, à une température de -34 ° C avant d'être plongés dans l'azote liquide (-196 ° C). Les embryons cryoconservés doivent être décongelés avant le transfert à un destinataire (substitut) des femmes. Pailles contenant les embryons sont retirés de l'azote liquide Dewar, tenue à la température ambiante de l'air pendant 3 à 5 secondes, et placé dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 25 à 30 sec. Les embryons cryoconservés dans Glyc sont placés dans une solution 1 M de saccharose de 10 min pour le retrait du CPA avant le transfert à un destinataire (substitut) des femmes. Les embryons cryoconservés dans EG, cependant, peuvent être directement transférés dans l'utérus d'un destinataire.

Protocole

1. Évaluer Aptitude cryoconservation d'embryons pour ^une

1. Les spécimens récoltés dans le tractus reproducteur des femelles de chaque donateur doit être placé dans un milieu isotonique embryon tenant pendant 10 minutes avant l'évaluation à l'aide d'un stéréomicroscope. Soyez certain de garder embryons de chaque femelle donneuse séparés les uns des autres pour permettre l'identification de filiation des descendants de transfert d'embryons.
2. En utilisant un faible grossissement (10X ≤), des spécimens d'une femelle de chaque donateur doivent être séparés en groupes distincts comprenant des ovules non fécondés, les embryons dégénérés, ou des embryons de qualité transférables. Niveau de qualité que de 1 ou 2 embryons au stade morula compacte par des stades de développement élargi blastocyste sont adaptés à la cryoconservation, et tous les autres doivent être écartées (à moins que des femelles receveuses synchrones sont disponibles pour la qualité de grade 3 embryons et un taux de grossesse après transfert d'environ 25 -30% est jugé acceptable).
3. Inspectez une classe de qualité et 2 morula compact grâce élargi embryons stade blastocyste à un grossissement 50X ≥ afin de s'assurer que la zone pellucide de l'embryon est intact et qu'il n'ya pas de matériel (par exemple, les cellules, le mucus) adhérant à la zone pellucide. Tout embryon par un fissurée ou manquante zone pellucide ou avec une zone pellucide ayant matières adhérentes doivent être séparés des autres embryons et, soit être éliminés ou traités séparément.

2. Les embryons de lavage pour réduire la probabilité de ² transmission des maladies

1. Déplacer zone pellucide intacte embryons dans un volume minimal de milieu isotonique embryon exploitation dans le premier puits de milieu de l'embryon à laver (par exemple, tampon phosphate salin augmentée avec des antibiotiques et l'albumine sérique bovine, sérum de veau nouveau-né, ou de l'alcool de polyvinyle). Gardez embryons de chaque femelle donneuse séparés, et ne pas essayer de laver plus de 10 embryons à la fois. Déplacer des embryons dans un volume minimal de milieu dans chaque lavage successifs pour parvenir à une dilution en série ≥ 1:100, et être certain d'utiliser stériles conseils de manipulation d'embryons qui sont changés entre chaque lavage successifs.
2. Déplacer embryons à 4 lavages comme décrit en 2.1.
3. Si la transmission de maladies virales est préoccupante, se laver deux fois embryons dans une solution de trypsine à 0,25%, pour un temps d'exposition totale combinée à la trypsine de pas plus de 90 secondes.
4. Après les deux lavages trypsine, se laver les embryons 5 fois plus dans le milieu de l'embryon à laver comme décrit en 2.1.
5. Après le lavage embryon final, placez-le dans l'embryon embryons isotonique tenant moyenne.

3. La déshydratation des embryons Avant de Cryoconservation ³

1. Les embryons devraient être transférés dans un volume minimal de milieu d'embryon tenant isotonique dans une solution hypertonique (01/04 à 01/05 concentration molaire) d'un agent cryoprotecteur (CPA), tels que l'éthylène glycol ou de glycérol.
2. Autoriser les embryons de s'asseoir dans un milieu de congélation (hypertonique solution CPA) jusqu'à ce qu'ils atteignent l'équilibre osmotique. Parce que l'éthylène glycol imprègne les cellules embryonnaires plus rapidement que ne le glycérol, les temps d'équilibration sont généralement moins d'embryons dans l'éthylène glycol (5 min) que dans le glycérol (10 min). Une partie de cette période d'équilibration peut être réalisé pendant et après les embryons sont chargés dans des pailles (décrit à l'étape suivante).

4. Chargement des embryons dans une paille en plastique de 0,25 ml pour la cryopréservation

1. Fixez l'extrémité du tampon de coton avec une paille en plastique de 0,25 ml (11,5 cm de longueur de travail) à un dispositif de chargement d'embryon, et aspirer environ 1,3 cm du CPA solution hypertonique dans une paille correctement étiquetés. Une variété de procédures d'étiquetage existe, y compris l'utilisation d'étiquettes imprimées soit attachée à un bouchon d'étanchéité de la paille ou à un autre de paille connecté avec un adaptateur de paille.
2. Retirez la paille de la solution de l'APC, et aspirer environ 0,15 cm d'air pour créer une bulle d'air minuscules dans la paille.
3. Aspirer un seul embryon à environ 0,8 cm du CPA solution hypertonique dans la paille.
4. Retirez la paille de la solution de l'APC et aspirer environ 0,15 cm d'air pour créer une bulle d'air minuscules secondes au sein de la paille (bulles d'air servent à isoler physiquement l'embryon au sein de la paille).
5. Aspirer environ 9,1 cm d'une solution de CPA pour remplir complètement la paille, être certain de tirer dans un volume suffisant de solution CPA pour humidifier le polychlorure de vinyle (PVC) de poudre qui existe au sein de la fin bouchon de coton de la paille. La solution CPA entraîne la poudre de PVC au gel et sceller cette extrémité de la paille.
6. Sceau l'autre bout de la paille avec de la poudre de PVC, plastique bouchons de paille, ou une thermoscelleuse.

5. Placer embryons dans une machine de congélation d'embryon Taux contrôlée

1. Soit bain de méthanol liquide ou de gel des machines d'azote vapeur peut être programmé pour la cryoconservation des embryons pré-implantatoire.
2. Chargez les pailles contenant les Embry OS dans une machine de congélation dont la température a été refroidi de la température ambiante à -6 ° C. Pailles Charge fin bouchon de coton vers le haut (à moins de plastique bouchons de paille ou de paille adaptateurs sont utilisés, dans lequel extrémité de la bougie cas du coton est placée vers le bas).
3. Autoriser embryons pour siéger à cette température pendant au moins 2 minutes avant de procéder.

6. Semis

1. Une fois que les embryons ont refroidi à -6 ° C, utiliser une paire de pinces en surfusion dans l'azote liquide (ou un bâton de coton-tige plongé dans l'azote liquide) pour induire la formation de cristaux de glace dans la solution de l'ACP à l'intérieur de la paille en touchant les pinces (ou de coton bâton de pointe) à la colonne de la solution soit au-dessus ou en dessous de l'embryon.
2. L'eau dans la solution de l'ACP va se cristalliser dans la région exposée à l'azote liquide, et des cristaux de glace se propage à la colonne de solution CPA entourant immédiatement l'embryon.
3. Tenez embryons au moment du semis température pendant 10 minutes avant de refroidir davantage.

7. La déshydratation continue d'embryons

1. Refroidir les embryons à un taux de 0,5 ° C / min jusqu'à une température de -34 ° C. Ce taux de refroidissement est important d'assurer la déshydratation continue de l'embryon.
2. Tenez embryons à -34 ° C pendant 10 minutes avant de plonger dans les embryons azote liquide (-196 ° C).
3. Placez cryoconservés embryons dans un gobelet convenablement étiquetés (rempli d'azote liquide) attaché à une canne à correctement étiquetés, et le lieu de la canne dans un bidon d'azote liquide une Dewar pour le stockage à court ou à long terme.

8. La décongélation des embryons cryoconservés

1. Tirez la cartouche dans le col de l'azote liquide Dewar, veillant à ce que la cartouche reste en dessous de la ligne de gel dans le Dewar.
2. Localisez la canne contenant l'embryon d'être décongelé, et rapidement et soigneusement enlever la paille de la coupe, étant certain de ne pas réchauffer les autres pailles dans le gobelet.
3. Tenez la paille dans l'air pendant 3-5 secondes (pour réduire l'incidence d'une zone pellucide craqué ^4), puis plonger dans un bain d'eau à 37 ° C pour un 25-30 secondes supplémentaires.
4. Retirer la paille du bain d'eau, essuyez-la paille (en faisant attention de ne pas maculer l'identification des embryons sur la paille), utiliser un appareil de la paille de coupe pour couper le bouchon d'extrémité non-coton de la paille (s'ils sont scellés ou de chaleur à l'aide de PVC en poudre ), ou bien enlever le bouchon d'étanchéité en plastique, et soit:
   1. charger la paille dans un dispositif de transfert d'embryons et le transfert le plus rapidement possible à un destinataire embryon synchrones (mais seulement si l'embryon a été cryoconservés en utilisant l'éthylène glycol comme l'ACP), ou
   2. tenir l'extrémité ouverte de la paille sur un plat contenant une concentration de 1,0 molaire de saccharose (un composé non-imprégnant), et utiliser une paire de ciseaux pour couper la fin bouchon de coton de la paille. Contenu de la paille doit circuler librement dans la solution de saccharose, mais poussant une petite colonne d'air à travers la paille peut être nécessaire si tout support résiduelle existe dans la paille. Autoriser les embryons de rester dans une solution de sucrose pendant 10 minutes, puis le transfert d'embryons dans l'embryon isotonique tenant moyen pendant 10 minutes. Évaluer embryons après décongélation, charger dans une paille nouvelle, et le transfert aux femelles receveur approprié.

9. Les résultats représentatifs:

Une variété de facteurs peuvent influer sur la grossesse et de vivre des taux de natalité résultant du transfert d'embryons décongelés préimplantatoire aux femelles receveuses synchrones ^5. Les embryons à des stades de développement moins avancée que morula compact ou plus avancé que blastocyste élargi souvent ne survivent pas au processus de cryoconservation des embryons ainsi que la morula compact, blastocyste précoce blastocyste, et élargi les stades du développement embryonnaire du blastocyste. Les embryons de grade 1 et 2 de la qualité de rendement plus élevé des taux de grossesse après décongélation que ne le font la qualité de grade 3 embryons (qui ne sont généralement pas cryoconservés en raison de la faiblesse des taux de grossesse après décongélation). Embryons malmené pendant la congélation des embryons ou à l'embryon le dégel des procédures sont susceptibles de présenter des taux de grossesse réduit. Les embryons transférés à des femelles receveuses dont les œstral cycles ne sont pas synchronisé avec celui de la femelle donneuse produisent généralement des taux de grossesse plus faible. Les embryons produits in vitro ou manipulé d'une certaine manière (par exemple, biopsie ou de traversée) donnent habituellement des taux de grossesse plus faible. Dans des conditions optimales, les taux de grossesses obtenues après transfert de décongelés embryons obtenus in vivo est généralement de 60-70% chez les bovins ^6,7, 65-75% chez les ovins ^8,9,10,11, et 60-70% chez les chèvres ^12,13,14,15. De même, les taux de grossesses obtenues après transfert de décongelés dans des embryons produits in vitro est généralement de 40-50% chez les bovins ^6,16, 25-35% chez les ovins ^17, et 30-40% chez les chèvres ^18.

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Tableau 1. Les taux de grossesse attendue après le transfert d'embryons décongelés à partir des espèces domestiques ruminants aux femelles receveuses synchrones.

Discussion

Parce que les embryons sont constitués principalement de l'eau, il est crucial que les embryons pré-implantatoire être adéquatement déshydratée et lentement refroidie en conformité avec le protocole décrit aux présentes afin d'éviter la formation de cristaux de glace intracellulaire. Une fois le processus de refroidissement a commencé, il est important de maintenir un changement de température unidirectionnel et d'éviter les fluctuations de température. Lancement de la formation de cristaux de glace («ensemencement») à une température appropriée pour la solution spécifique CPA est critique.

Toute modification de ce refroidissement lent / rapide méthode de décongélation pour la cryoconservation d'embryons pré-implantatoire comprennent la méthode en une étape (où la dernière colonne du milieu chargé dans la paille est le saccharose, au lieu d'une solution de CPA) ¹⁹ et la méthode de transfert direct (où des embryons congelés dans l'éthylène glycol sont décongelés et transférés directement à l'utérus d'une femelle receveuse sans d'abord enlever l'éthylène glycol à partir de l'embryon) ^20. Pour réduire le volume de l'éthylène glycol déposés dans l'utérus d'un transfert direct (DT) femelle receveuse, il est recommandé de remplir la paille 0,25 ml avec 6 cm tenant moyenne avant de continuer comme décrit précédemment. Il convient de noter que d'une norme volontaire existe au sein de l'industrie du transfert de l'embryon préimplantatoire commerciales que les embryons cryoconservés pour DT devrait être congelés dans de couleur jaune paille et stockés dans des gobelets de couleur jaune dans l'azote liquide Dewar. L'industrie commerciale a aussi des exigences spécifiques d'étiquetage pour tous les embryons cryoconservés qui devraient être suivies.

Une alternative à cette méthode est la vitrification ^21, une méthode non-équilibre de la cryoconservation, où une plus forte concentration (6-8 M) solution de l'APC est refroidi ultra-rapide provoquant la solution CPA de changer de liquide à une "glassy" état ​​sans glace cristal de la formation. La vitrification est probablement mieux adapté pour la cryoconservation des embryons qui sont moins avancés que développemental morula compacte en raison de leur sensibilité à la température augmente.

Cette technique a des applications pour la conservation des ressources génétiques uniques ^22, ainsi que pour l'industrie internationale des embryons commerciaux de transfert où plus de 55% d'environ 500.000 embryons bovins préimplantatoire transféré dans l'année civile 2008 ont été cryopréservés. ²³

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Le numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Moyennes gel BioLife	Agtech, Inc	C18, C18A	1,5 M d'éthylène glycol
Emcare d'éthylène glycol solution de gel de	ICPBio reproduction	IC8, IC10	1,5 M d'éthylène glycol
Gel des Vigro éthylène glycol ainsi	Bioniche Animal Health	EVM835	1,5 M d'éthylène glycol
Emcare solution à 10% de glycérol gel	ICPBio reproduction	IC12	1,34 M de glycérol
Emcare une dégel M de saccharose	ICPBio reproduction	IC16	1,0 M de saccharose
Vigro une étape de dégel	Bioniche Animal Health	EVM247, EVM847	1,0 M de saccharose
Vigro dégel 1-2-3, plus	Bioniche Animal Health	EVM248, EVM848	5%, 2,5%, 0% de glycérine avec 0,5, 0,5, 0,6% de saccharose
Emcare CSU dégel kit	ICPBio reproduction	IC20	6%, 3%, 0% de glycérine avec du saccharose de 10,3%
BioLife holding et moyen de transfert	Agtech, Inc	C15, C15A	modifiés PBS avec 0,4% de BSA (sérum albumine bovine)
Emcare tenant solution	ICPBio reproduction	IC2, IC4, IC6	0,4% de BSA (sérum albumine bovine), tampon MOPS (zwitterions inerte)
Vigro détenant plus de	Bioniche Animal Health	EVM024, EVM824
Tenir SYNGRO moyennes	Bioniche Animal Health	ESM024, ESM224, ESM828	contient hyaluronane; aucun produit d'origine animale
BioLife modifiés D-PBS	Agtech, Inc	C06	phosphate de Dulbecco modifié saline tamponnée
BioLife Fraction V BSA	Agtech, Inc	B09	lyophilisée de sérum albumine bovine fraction V
BioLife antibiotiques antimycosiques	Agtech, Inc	B01	amphotéricine B, la pénicilline G, du sulfate de streptomycine
BioLife trypsine kit	Agtech, Inc	C22A	25 g de trypsine lyophilisée, de l'eau stérile, stérile D-PBS

Nom de l'équipement	Société	Le numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Biol-Cool congélateur vitesse contrôlée	Systèmes FTS	BC-IV -40	Congélateur bain de méthanol
Gel congélateur taux de contrôle contrôlé	Cryologic	CL2200	Congélateur à azote liquide