El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

Resumen

La oferta de la diabetes tipo 2 isletas para la investigación es insuficiente. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial. Este enfoque representa un lugar único para la obtención de islotes de diabetes tipo 2 y clínicamente emparejado sujetos no diabéticos en un número suficiente de estudios básicos y clínicos.

Resumen

Las investigaciones sobre la patogénesis de la diabetes tipo 2 y los islotes de Langerhans ^un mal funcionamiento se han visto obstaculizadas por la limitada disponibilidad de islotes con diabetes tipo 2 de ² donantes de órganos. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de tejido pancreático humano obtenido de diabetes tipo 2 y pacientes no diabéticos que han sido sometidos a pancreatectomía parcial debido a diferentes enfermedades pancreáticas (tumores benignos o malignos de páncreas, pancreatitis crónica, y el conducto biliar común o tumores duodenales) . Todos los pacientes involucrados dieron su consentimiento para este estudio, que también había sido aprobado por el comité de ética local. Los especímenes quirúrgicos fueron entregados inmediatamente al patólogo que seleccionaron suave y saludable del tejido pancreático que aparecen para el aislamiento de los islotes, conservando el tejido dañado con fines de diagnóstico. Hemos encontrado que aislar más de 1.000 islotes, que teníamos que empezar con al menos 2 g de tejido pancreático. También es esencial para nuestro protocolo fue visible para distender los tejidos cuando se inyectan los medios de comunicación que contienen enzimas y, posteriormente, pelos para facilitar la digestión, aumentando la superficie.

Para ampliar la aplicabilidad de nuestro protocolo para incluir los casos ocasionales en los que una gran cantidad (> 15 g) de tejido pancreático humano está disponible, se utilizó una cámara de Ricordi (50 ml) a digerir el tejido. Durante la digestión, que sacudió de forma manual de la cámara de Ricordi ³ con una intensidad que varía por el modelo de acuerdo a su nivel de fibrosis de los tejidos. Un gradiente de Ficoll discontinuo se utilizó para separar los islotes del tejido acinar. Hemos tomado nota de que el precipitado de tejido debe ser lo suficientemente pequeño como para ser homogénea resuspendieron en medio Ficoll con una densidad de 1,125 g / ml. Tras el aislamiento, que cultivan los islotes en condiciones de estrés (sin agitación o rotación) con 5% de CO ₂ a 37 ° C durante al menos 48 h con el fin de facilitar su recuperación funcional. La aplicación generalizada de nuestro protocolo y sus mejoras en el futuro podría permitir la recolección oportuna de grandes cantidades de islotes humanos de la diabetes y la clínica con sujetos no diabéticos, en gran medida el avance de investigación de tipo 2 diabetes.

Protocolo

1. La colección de tejidos del páncreas en la sala de operaciones

1. El cirujano realiza una resección parcial del páncreas.
2. Después de colocar la muestra de páncreas en una caja de hielo, de presentar inmediatamente al patólogo.

2. Selección del tejido para el aislamiento de islotes

1. El patólogo selecciona tejido que parece suave y saludable, manteniendo el tejido dañado con fines de diagnóstico. Tejido fibrótico y las muestras que ofrecen menos de 2 g de tejido útil están excluidos de aislamiento de islotes.
2. Sumergir el tejido pancreático en euros solución Collins y entregar en hielo al laboratorio.

3. Aislamiento de islotes humanos

1. Pese el tejido pancreático, a continuación, colóquelo en un plato de 10 cm.
2. Ponga 150 ml RPMI medios de comunicación en un frasco de 500 ml.
3. En un matraz de 250 ml, prepare la solución de enzimas digestivas mediante la combinación de 130 ml RPMI medios de comunicación con 100 mg / ml y 20 ml DNasa de RI Liberase 5mg/ml. Draw 10 ml de esta solución en una jeringa para inyectar el tejido pancreático.
4. Se inyecta la solución de enzimas digestivas en el tejido pancreático, con el objetivo de que se distienden homogénea. Si se trata de prevenir la fibrosis, la digestión es probable que no. A continuación, picar los tejidos en ~ 4 mm ³ piezas en el hielo.

4. Páncreas humano circuito de la digestión

1. Montar el circuito de la digestión, como se muestra en la Figura 1. La dirección del flujo en la cámara de Ricordi se encuentra en la parte inferior y salida en la parte superior de la cámara.
2. Añadir la solución de enzimas digestivas restante en el matraz de 500 ml hasta un volumen total de 300 ml e insertar un termómetro.
3. Transferir el tejido pancreático en la cámara, inserte la malla (diámetro de poro: 600 m) y tres canicas de nitruro de silicio (diámetro: 15 mm), cerca de la cámara y encienda la bomba con el caudal fijado en 140 ml / min.
4. Cuando la temperatura del circuito llega a 37 ° C, iniciar el cronometraje y periódicamente toman muestras para determinar el momento de detener la digestión. Tinción con ditizona (2 mg / ml) permite la visualización microscópica de los islotes dentro del tejido digerido ^4.
5. Una vez que los islotes están separados del tejido acinar alrededores, rápidamente detener la digestión mediante la colocación de la bobina de calentamiento sobre el hielo y añadir 200 ml de medio de lavado en frío (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) al circuito.
6. Recoger la solución de los islotes en 250 ml tubos cónicos como sale del tubo de muestra. Continúe hasta que el circuito está vacío.

Figura 1. El circuito de la digestión humana páncreas El páncreas circuito de la digestión humana incluye una cámara de Ricordi que contiene la malla (diámetro de poro: 600 m) y tres bolas de nitruro de silicio (diámetro: 15 mm). Salida de la cámara es impulsada en el matraz de recogida de tejidos por la bomba peristáltica (140 ml / min). Las flechas indican la dirección del flujo. Una temperatura óptima para la digestión enzimática se mantiene mediante la inmersión de la bobina de calentamiento en un baño de agua a 37 ° C.

5. Lavado después de la digestión

1. Centrífuga de 250 ml tubos cónicos que contengan la solución de los islotes a 1.000 rpm, 4 º C durante 5 min.
2. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado de los islotes en los medios de comunicación de lavado (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) y distribuirlo en fracciones iguales a tubos de 50 ml cónicos. (Opcional:. Distribuir en tubos cónicos adicionales para mejorar el lavado) Se centrifuga a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min.
3. Desechar el sobrenadante y extraiga con cuidado pellets por agitación manual.

6. La purificación en un gradiente de Ficoll

1. Resuspender el precipitado con Ficoll los medios de comunicación a una densidad de 1,125 g / ml, pH 7,4, y poco a poco superposición de alícuotas de 10 ml de Ficoll los medios de comunicación con una densidad de 1,080, 1,060 y 1,037 g / ml.
2. Centrifugar los gradientes de Ficoll a 2400 rpm, 4 º C durante 20 min.

7. Colección islote y Cultura

1. Después de la centrifugación, los diferentes componentes del tejido se pueden distinguir por su repartición en el degradado.
2. Descartar la capa superior que consta de grasa y tejido conectivo.
3. Con cuidado, la cosecha de la primera capa de áridos islote en la 1.037-1.060 g / ml interfase. Esta capa contiene los islotes aislados más puro. Recoger las fracciones por separado para el aislamiento eficiente.
4. Recoger la fracción de segundo, menos puro de los agregados de los islotes en el 1.060-1.080 g / ml interfase.
5. Diluir el gradiente de Ficoll mediante la adición de medio de lavado (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) a cada tubo cónico hasta un volumen total de 50 ml. Centrifugar a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min.
6. Eliminar el sobrenadante por aspiración. Tenga cuidado de que la pastilla esté suelto debido al gradiente de Ficoll.
7. Lave el wi pelletsª lavar los medios de comunicación (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) y se centrifuga a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. Repita el uso de los medios de comunicación islote cultura
8. Resuspender los islotes en los medios de cultivo y colocarlos en la incubadora con 5% de CO ₂ a 37 ° C durante 24-48 horas antes de su posterior procesamiento.

Resultados

Nuestro protocolo se obtuvo un promedio de ~ 500 islotes por gramo de tejido pancreático, aunque este muy variado entre los preparados debido en gran parte a diferencias en la fibrosis y la actividad de la colagenasa. Hemos conseguido> 90% de pureza islote mediante tinción primero con ditizona durante el procesamiento de tejidos, y luego eligiendo a dedo 24 horas después de su aislamiento. Para determinar la calidad de los islotes purificados, la prueba de 25 mM de glucosa estimulada por la secreción de insulina en condiciones estáticas durante 2 horas. Hemos encontrado la secreción de insulina comparable a la de islotes obtenidos de ECIT aislamiento de islotes y los centros de trasplante. Como islotes aislados de páncreas parcialmente pancreatectomized no son para el trasplante de islotes, la evaluación del IEQ total no se considera un factor crítico.

Es importante destacar que nuestro método nos ha permitido aislar los islotes de los estudios funcionales de 25 pacientes parcial pancreatectomized entre 2005 y 2008 ^5. Estos islotes fueron analizados para la glucosa estimulada por la secreción de insulina y la expresión de proteínas por Western Blot e inmunohistoquímica. Islotes aislados de parte pancreatecomized páncreas también podría ser utilizado para comparar los genes y los perfiles de expresión de proteínas, el aspecto ultraestructural y las respuestas funcionales de los islotes no diabéticos y diabéticos. Debido a que hay mayor número de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial que existen donantes de órganos, el protocolo podría permitir suficientes muestras y datos que se recojan para el análisis estadístico robusto.

Discusión

Utilizando el protocolo, los islotes se pueden aislar a partir de tejido pancreático recogidos de una pancreatectomía parcial. El éxito de este protocolo se basa en el cuidado durante un pocos puntos críticos. Para preservar la viabilidad de las células beta, es esencial que la muestra se transporta rápidamente en hielo al laboratorio. Además, la duración de la digestión de los tejidos deben ser optimizados empíricamente de acuerdo con el grado de fibrosis del tejido y la actividad enzimática de los medios de comunicación. Esto también es válido para el grado de fuerza mecánica aplicada manualmente a la cámara de Ricordi. Así, para obtener un rendimiento islote bien, el protocolo se realiza mejor por un científico dedicado o asistente técnico. El fracaso inicial de la norma es menos que el equipo ya tiene experiencia en el aislamiento de los islotes.

Hay diferencias fundamentales entre el protocolo de aislamiento de islotes y el método estándar de aislamiento de islotes humanos: 1) A pesar de que el uso de tejido pancreático sometido a varias horas de isquemia durante el procedimiento quirúrgico, éstos son procesados ​​inmediatamente en el sitio. Esto está en contraste con páncreas explantados de donantes con muerte cerebral para el trasplante de páncreas / islote, que siguen siendo isquémica por varias horas durante la asignación y entrega a la instalación de aislamiento de islotes. 2) Se inyecta colagenasa directamente en el tejido pancreático, mientras que el protocolo estándar para infundir en el conducto pancreático. 3) Se separan los islotes mediante un gradiente de Ficoll discontinuo en vez de recoger los islotes a partir de un gradiente de Ficoll continua usando un procesador celular COBE.

En los casos en que la pieza quirúrgica es demasiado fibroso o escasos para el aislamiento de un número suficiente de islotes, el tejido todavía pueden ser recuperados por microdisección de captura láser (LCM) ^10. Esto permite que los datos de expresión genética para recuperarse de prácticamente todas las muestras, aunque el aislamiento de islotes falla o el rendimiento es muy bajo. Desafortunadamente, la LCM no produce las células vivas para estudios funcionales y su cantidad suele ser insuficiente para el análisis proteómico. Por lo tanto, con LCM en paralelo con nuestro protocolo de digestión con colagenasa para recuperar los islotes puede ser la forma más eficaz de procesar las muestras quirúrgicas.

En la recogida de tejidos para el aislamiento de los islotes de pancreatectomías parcial, es importante examinar cuidadosamente la historia clínica del paciente y su estado metabólico. Un paciente parcialmente pancreatectomized podrían verse afectados por diabetes tipo 3c, es decir, diabetes secundarias a la enfermedad del páncreas que conduce a la cirugía ^6. De los 43 pacientes participantes que se sometieron a esta cirugía en nuestro departamento en el 2010, 32 eran no diabéticos, 5 fueron afectados por diabetes tipo 2 y 6 tenían diabetes tipo 3c. Estos datos concuerdan con estudios anteriores que señalaban que el metabolismo de la glucosa y diabetes en una fracción considerable de pacientes que sufren de cáncer de páncreas o pancreatitis crónica ^6. Hemos considerado la diabetes de origen primario, si se le diagnosticó al menos un año antes de la aparición de los síntomas que conducen a la cirugía pancreática ^7. Los niveles de anticuerpos contra los islotes autoantígenos también debe medirse para evaluar la posibilidad de un origen autoinmune de la diabetes ^8. Debido a que un paciente sometido a pancreatectomía podría sufrir de diabetes no diagnosticada o ser intolerantes a la glucosa, los pacientes no diabéticos, se debe dar una prueba de sobrecarga oral de glucosa antes de la pancreatectomía ^9.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Número de catálogo
Equipo
1 ml serológicas pipeta (CellStar)	Greiner Bio-One	604181
10 ml serológicas pipeta (CellStar)	Greiner Bio-One	607180
25 ml serológicas pipeta (CellStar)	Greiner Bio-One	760180
10 ml jeringa	BD (Becton, Dickinson and Company)	300912
50 ml jeringa	BD (Becton, Dickinson and Company)	300865
5 ml jeringa	BD (Becton, Dickinson and Company)	309050
18 G 1,1 / 2 Aguja Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	304622
27 GX1 / 2 agujas	Braun	4658300
27 GX3 / 4 agujas Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	302200
3 cm de células cultura plato de 2x2 mm rejilla	Nunc	174926
20 cm de tejido cultura plato	BD (Becton, Dickinson and Company)	353003
6 cm de agarre fácil una caja de petri	BD (Becton, Dickinson and Company)	351016
150 ml botella de almacenamiento	Corning Incorporated	431175
250 ml Erlenmeyer	Schott Duran	21 217 36
500 ml Erlenmeyer	Schott Duran	21 217 44
250 ml de tornillo tapa inferior del tubo cónico de centrífuga	Corning Incorporated	430776
Falcon de 50 ml cónica del tubo	BD (Becton, Dickinson and Company)	352070
260 ml Easyflask no tratados	Nunc	156800
Millex GV filtro Unidad Duropore (0,22 m)	Millipore	SLGV033RB
Para botellas de vacío del filtro (PES 70 mm de diámetro Membranas, 0,22 m de tamaño de los poros, 45 mm de tamaño del cuello, 500 ml de volumen)	Corning Incorporated	431118
Densitómetro (Densito 30PX) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Unidad de filtro rápido PES 0,2 micras	Nalgene	569-0020
Calentamiento de la bobina	Biorep Technologies Inc	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Tipo de bomba PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi cámara (malla de metal con un diámetro de 600 micras de poro)	Biorep Technologies Inc.	Modelo 50-U-01, serie 0503-001
Preparación de soporte	Biorep Technologies Inc.	50-PS-01
O-Rings	Biorep Technologies Inc.	O-50-U-01
Nitruro de silicio Mármoles (15 mm conjunto de 9)	Biorep Technologies Inc.	SN-01
Tubos de silicona	Tygon	R 3603 8,0 X4, 0 mm
Fórceps quirúrgicos	Braun	BD168R
Tijeras quirúrgicas (Aesculap)	Braun	BC273R
Baño de agua MCO 200	Conceder	MCO 200
Reactivos
Colagenasa -> Liberase RI (100 mg)	Roche	11815032001
D (+)-glucosa	Merck	1.08337.1000
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	Sigma Aldrich	D5130
DNasa I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1XPBS	PAA Laboratories	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
De suero fetal bovino (FBS)	PAA Laboratories	A15-101
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378
Suero bovino fetal (FBS)	Gibco	10270-106
2 - (4 - (2-hidroxietil) - 1-piperazinil)-ethansulfons ‰ Ure (HEPES)	Roth	9105.3
NaOH, 5 M	farmacia clínica, hospital	-
Penicilina / estreptomicina (100 veces)	PAA Laboratories	P11-010
Pipettaid (EXPRESS)	BD (Becton, Dickinson and Company)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate anhidro	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
Medio RPMI 1640 [-] D-glucosa [+] L-Glutamina	Gibco	11879-020
Medio RPMI 1640 [+] L-Glutamina	PAA Laboratories	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500