Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

Riepilogo

La fornitura di diabete di tipo 2 isolotti per la ricerca è insufficiente. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare isolotti da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo approccio rappresenta un luogo unico per l'ottenimento di isolotti da diabete di tipo 2 e clinicamente abbinati soggetti non diabetici ed in numero sufficiente per gli studi di base e clinica.

Abstract

Indagini sulla patogenesi del diabete di tipo 2 e le isole di Langerhans malfunzionamento ¹ sono stati ostacolati dalla limitata disponibilità di isolette con diabete di tipo 2 da donatori di organi ^2. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare dal tessuto isole pancreatiche umane ottenute da diabete di tipo 2 e pazienti non diabetici che hanno subito pancreatectomia parziale a causa di diverse malattie del pancreas (tumori benigni o maligni del pancreas, pancreatite cronica, e del dotto biliare comune o tumori duodenali) . Tutti i pazienti coinvolti hanno dato il loro consenso a questo studio, che era stato approvato dal comitato etico locale. I campioni chirurgici sono stati immediatamente consegnati al patologo che hanno selezionato morbido e sano tessuto pancreatico che appaiono per l'isolamento delle isole, mantenendo il tessuto danneggiato per scopi diagnostici. Abbiamo scoperto che per isolare più di 1.000 isole, abbiamo dovuto iniziare con almeno 2 g di tessuto pancreatico. Anche essenziale per il nostro protocollo è stato quello di distendere visibilmente il tessuto quando si somministra l'enzima contenente i media e successivamente macinata per aiutare la digestione, aumentando la superficie.

Per estendere l'applicabilità del nostro protocollo di includere il caso in cui occasionalmente una quantità di grandi dimensioni (> 15 g) di tessuto pancreatico umano è disponibile, abbiamo usato una camera di Ricordi (50 ml) per digerire il tessuto. Durante la digestione, si scosse manualmente la camera di Ricordi ³ a un'intensità che varia da campione in base al suo livello di fibrosi tissutale. Un gradiente discontinuo Ficoll è stato poi utilizzato per separare le isolette dal tessuto acinare. Abbiamo notato che il precipitato di tessuto dovrebbe essere abbastanza piccolo da essere omogeneamente risospeso in medium Ficoll con una densità di 1,125 g / ml. Dopo l'isolamento, abbiamo colto gli isolotti in condizioni di stress (senza agitazione o rotazione) con il 5% CO ₂ a 37 ° C per almeno 48 ore al fine di facilitare il loro recupero funzionale. Applicazione diffusa del nostro protocollo e il suo miglioramento futuro potrebbe consentire la raccolta puntuale di grandi quantità di isole umane da diabetici e clinicamente abbinati soggetti non diabetici, notevolmente avanzando la ricerca sul diabete di tipo 2.

Protocollo

1. Collezione di tessuti del pancreas in sala operatoria

1. Il chirurgo esegue una resezione parziale del pancreas.
2. Dopo aver posizionato il campione del pancreas in una scatola su ghiaccio, lo consegnerà immediatamente al patologo.

2. Selezione dei tessuti per l'isolamento delle isole

1. Il patologo seleziona tessuto che appare morbida e sana, mantenendo il tessuto danneggiato per scopi diagnostici. Campioni di tessuto fibrotico e offrendo meno di 2 g di tessuto utilizzabile sono esclusi dalla isolamento delle isole.
2. Immergere il tessuto pancreatico in soluzione di Euro Collins e fornire sul ghiaccio al laboratorio.

3. Isolamento di isole umane

1. Pesare il tessuto pancreatico, poi metterlo in un piatto da 10 cm.
2. Mettere 150 ml RPMI dei media in un pallone da 500 ml.
3. In un pallone da 250 ml, preparare la soluzione enzima digestivo, combinando 130 ml RPMI media con 100 mg / ml di DNasi e 20 ml di RI Liberase 5mg/ml. Disegna 10 ml di questa soluzione in una siringa per iniettare il tessuto pancreatico.
4. Iniettare la soluzione di enzima digestivo nel tessuto pancreatico, al fine di distendere la omogeneo. Se questo è impedito da fibrosi, la digestione probabilmente fallire. Poi, tritare il tessuto in ~ 4 mm ³ pezzi su ghiaccio.

4. Pancreas umano circuito digestione

1. Montare il circuito digestione, come mostrato nella Figura 1. La direzione del flusso nella camera di Ricordi è in basso e fuori nella parte alta della camera.
2. Aggiungere la restante soluzione enzima digestivo al pallone da 500 ml fino ad un volume totale di 300 ml e inserire un termometro.
3. Trasferire il tessuto pancreatico nella camera, inserire le maglie (pori di diametro: 600 micron) e tre Marmi nitruro di silicio (diametro: 15 mm), chiudere la camera e avviare la pompa con il flusso fissato a 140 ml / min.
4. Quando la temperatura del circuito raggiunge i 37 ° C, inizio i tempi e periodicamente prelevare campioni per determinare quando interrompere la digestione. Colorazione con ditizone (2 mg / ml) permette la visualizzazione di isolette microscopiche all'interno del tessuto digerito ^4.
5. Una volta le isole sono separate dal tessuto acinare circostante, in modo rapido fermare la digestione ponendo la batteria di riscaldamento sul ghiaccio e aggiungendo 200 ml di supporti lavaggio a freddo (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) al circuito.
6. Raccogliere la soluzione isolotto in 250 ml provette coniche come si esce dalla provetta. Continuare fino a quando il circuito è vuoto.

Figura 1. L'uomo circuito digestione pancreas Il pancreas umano circuito digestione comprende una camera di Ricordi che contiene mesh (pori di diametro: 600 micron) e tre palline di nitruro di silicio (diametro: 15 mm). Uscita dalla camera è spinto al pallone raccolta tessuto dalla pompa peristaltica (140 ml / min). Le frecce indicano la direzione del flusso. Una temperatura ottimale per la digestione enzimatica viene mantenuta immergendo la bobina di riscaldamento in un bagno d'acqua a 37 ° C.

5. Lavaggio post-digestione

1. Centrifuga da 250 ml provette coniche contenente la soluzione isolotto a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min.
2. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet isolotto a lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e distribuirlo in frazioni pari a 50 ml provette coniche. (Opzionale:. Distribuire in tubi conici aggiuntive per migliorare il lavaggio) Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min.
3. Gettare il surnatante e delicatamente allentare pellet agitando manuale.

6. Purificazione su un gradiente di Ficoll

1. Risospendere il pellet con Ficoll i media ad una densità di 1,125 g / ml, pH 7.4 e lentamente sovrapposizione di 10 ml di Ficoll mezzi con densità di 1,080, 1,060 e 1,037 g / ml.
2. Centrifugare i gradienti di Ficoll a 2400 rpm, 4 ° C per 20 min.

7. Isolotto Raccolta e Cultura

1. Dopo la centrifugazione, componenti del tessuto differenti si distinguono per la loro scomposizione del gradiente.
2. Eliminare lo strato superiore costituito da grassi e tessuto connettivo.
3. Accuratamente raccolto il primo strato di inerti isolotto alla g / ml 1,037-1,060 interfase. Questo strato contiene le isole più puro isolato. Raccogliere separatamente le frazioni per l'isolamento efficiente.
4. Raccogliere la seconda frazione meno puro di aggregati isolotto alla g / ml 1,060-1,080 interfase.
5. Diluire il gradiente di Ficoll con l'aggiunta di lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) a ciascuna provetta conica fino ad un volume totale di 50 ml. Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min.
6. Eliminare il surnatante tramite aspirazione. Usare la stessa attenzione il pellet potrebbe essere sciolto a causa del gradiente di Ficoll.
7. Lavare il wi pellet° lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Ripetere utilizzando terreni di coltura isolotto
8. Risospendere le isolette in terreni di coltura e metterli in incubatore al 5% di CO ₂ a 37 ° C per 24-48 ore prima di ulteriori elaborazioni.

Risultati

Il nostro protocollo ha dato una media di circa 500 isolotti per grammo di tessuto pancreatico, anche se questo varia notevolmente tra i preparati in gran parte dovuta a differenze di fibrosi e di attività collagenasi. Abbiamo raggiunto la purezza isolotto> 90% dalla colorazione prima con ditizone durante la lavorazione dei tessuti, poi 24 ore dopo la raccolta manuale isolamento. Per determinare la qualità delle isole purificate, abbiamo testato per 25 mM glucosio-stimolata la secrezione di insulina in condizioni statiche per 2 ore. Abbiamo trovato la secrezione di insulina paragonabile a quella di isolotti ottenuto dall'isolamento ECIT isole e centri di trapianto. Come isolette isolate dal pancreas parzialmente pancreatectomized non sono stati pensati per il trapianto di isole, la valutazione della IEQ totale non è stato considerato un fattore critico.

È importante sottolineare che il nostro metodo ci ha permesso di isolare isolotti per gli studi funzionali da 25 pazienti parziale pancreatectomized tra il 2005 e 2008 ^5. Queste isole sono stati analizzati per il glucosio-stimolata la secrezione di insulina e di espressione delle proteine ​​specifiche da western blotting ed immunoistochimica. Isolette isolate da parte pancreatecomized pancreas potrebbe anche essere utilizzato per confrontare profili di espressione genica e proteica, l'aspetto ultrastrutturale e le risposte funzionali di isole non-diabetici e diabetici. Perché ci sono più pazienti sottoposti a pancreatectomia parziali che ci sono donatori di organi, il nostro protocollo potrebbe consentire abbastanza campioni e dati da raccogliere per una ben fondata analisi statistica.

Discussione

Utilizzando il nostro protocollo, isole umane può essere isolato dal tessuto pancreatico prelevato da un pancreatectomia parziale. Il successo di questo protocollo si basa sulla cura posta nella alcuni punti critici. Per preservare la vitalità delle cellule beta, è essenziale che il campione da trasportare rapidamente sul ghiaccio al laboratorio. Inoltre, la durata della digestione dei tessuti deve essere ottimizzata empiricamente a seconda del grado di fibrosi dei tessuti e l'attività enzimatica dei media. Questo vale anche per il grado di forza meccanica applicata manualmente alla camera di Ricordi. In tal modo di ottenere un buon rendimento isolotto, il protocollo è meglio eseguita da uno scienziato dedicato o assistente tecnico. Errore iniziale è la norma a meno che la squadra è già sperimentato in isolamento isole.

Ci sono differenze fondamentali tra il nostro protocollo isolotto isolamento e lo standard umano metodo di isolamento delle isole: 1) Anche se usiamo tessuto pancreatico sottoposto a diverse ore di ischemia durante la procedura chirurgica, viene immediatamente trasformato in loco. Questo è in contrasto con pancreas espiantati da donatori in morte cerebrale per il pancreas / trapianto di isole, che rimangono ischemico per diverse ore durante l'assegnazione e la consegna alla struttura isolamento delle isole. 2) Noi collagenasi iniettare direttamente nel tessuto pancreatico, mentre il protocollo standard è quello di infondere in dotto pancreatico. 3) Abbiamo separato le isole con un gradiente discontinuo Ficoll invece di raccogliere le isolette da un gradiente Ficoll continuo utilizzando un processore COBE cellula.

Nei casi in cui il campione chirurgico è troppo fibrotica o scarsa per isolare un numero adeguato di isolotti, il tessuto può essere ancora recuperato la cattura microdissezione laser (LCM) ^10. Questo permette ai dati di espressione genica da recuperare praticamente ogni esemplare, anche se l'isolamento delle isole non riesce o la resa è molto bassa. Purtroppo, LCM non produce le cellule viventi per gli studi funzionali e il loro ammontare è di solito insufficiente per l'analisi proteomica. Così, con LCM in parallelo con il nostro protocollo collagenasi digestione per recuperare le isole possono essere il modo più efficace al processo di campioni chirurgici.

Quando si raccolgono i tessuti per l'isolamento delle isole da pancreatectomies parziale, è importante esaminare attentamente la storia clinica del paziente e stato metabolico. Un paziente parzialmente pancreatectomized potrebbero essere interessati dal tipo 3c diabete, il diabete secondario cioè al disordine del pancreas porta alla chirurgia ^6. Tra i 43 pazienti partecipanti che hanno subito questo intervento nel nostro reparto nel 2010, 32 erano non-diabetici, 5 erano affetti da diabete di tipo 2 e 6 avevano il diabete di tipo 3c. Questi dati concordano con gli studi precedenti che punta al metabolismo del glucosio e diabete in una frazione considerevole di pazienti affetti da cancro al pancreas o pancreatite cronica ^6. Abbiamo considerato il diabete sia di origine primaria, se è stato diagnosticato da almeno un anno prima della comparsa dei sintomi principali della chirurgia pancreatica ^7. I livelli di anticorpi contro l'isolotto autoantigeni deve essere misurato per valutare un potenziale origine autoimmune del diabete ^8. Perché un paziente sottoposto ad pancreatectomia potrebbe soffrire di diabete non diagnosticato o essere intolleranti al glucosio, tutti i pazienti non diabetici devono assumere un test orale di tolleranza al glucosio prima della pancreatectomia ^9.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero di catalogo
Attrezzatura
1 ml pipetta sierologica (Cellstar)	Greiner Bio-One	604181
10 ml pipetta sierologica (Cellstar)	Greiner Bio-One	607180
25 ml pipetta sierologica (Cellstar)	Greiner Bio-One	760180
Siringa da 10 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	300912
Siringa da 50 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	300865
Siringa da 5 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	309050
18 G 1,1 / 2 Ago Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	304622
27 GX1 / 2 aghi	Braun	4658300
27 GX3 / 4 Microlance dell'ago 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	302200
3 centimetri coltura cellulare piatto 2x2 mm griglia	Nunc	174926
20 centimetri tessuto piatto cultura	BD (Becton, Dickinson and Company)	353003
6 centimetri piatto facile presa petri	BD (Becton, Dickinson and Company)	351016
150 ml di stoccaggio bottiglia	Corning Incorporated	431175
250 ml beute	Schott Duran	217 21 36
500 ml beute	Schott Duran	217 21 44
250 ml Tappo a vite conica inferiore provetta	Corning Incorporated	430776
50 ml Falcon conica del tubo	BD (Becton, Dickinson and Company)	352070
260 ml Easyflask non trattati	Nunc	156800
Millex GV Filtro Unità Duropore (0,22 micron)	Millipore	SLGV033RB
Bottiglia vuoto Top filtro (PES 70 millimetri Diametro Membran, 0,22 micron dimensione dei pori, 45 collo di dimensione mm, 500 ml)	Corning Incorporated	431118
Densitometro (Densito 30PX) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Veloce Unità PES filtro 0,2 micron	Nalgene	569-0020
Riscaldamento Coil	BioRep Technologies Inc	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Pompa Tipo PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi camera (rete metallica con 600 micron di diametro dei pori)	BioRep Technologies Inc.	Modello 50-U-01, Serial 0503-001
Preparazione stand	BioRep Technologies Inc.	50-PS-01
O-Ring	BioRep Technologies Inc.	O-50-U-01
Marmi nitruro di silicio (15 mm di serie 9)	BioRep Technologies Inc.	SN-01
Tubi in silicone	Tygon	R 3603 8,0 X4, 0 mm
Pinze chirurgiche	Braun	BD168R
Forbici chirurgiche (Aesculap)	Braun	BC273R
Bagnomaria OLS 200	Concedere	OLS 200
Reagenti
Collagenasi -> RI Liberase (100 mg)	Roche	11815032001
D (+)-glucosio	Merck	1.08337.1000
Dimetilsolfossido (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	Sigma Aldrich	D5130
DNasi I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA Laboratori	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
Siero fetale bovino (FBS)	PAA Laboratori	A15-101
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	10270-106
2 - (4 - (2-idrossietil) - 1-piperazinyl)-ethansulfons ‰ URE (HEPES)	Roth	9105,3
NaOH, 5 M	farmacia clinica, ospedale	-
Penicillina / streptomicina (100x)	PAA Laboratori	P11-010
Pipettaid (EXPRESS)	BD (Becton, Dickinson and Company)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate anidro	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
RPMI Media 1640 [-] D-glucosio [+] L-Glutammina	Gibco	11879-020
RPMI Media 1640 [+] L-Glutammina	PAA Laboratori	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500