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Method Article
Este documento presenta un enfoque combinado de fotoestimulación láser con las grabaciones de células enteras en ratones transgénicos que expresan GFP en poblaciones de neuronas inhibidoras limitan. La técnica permite la cartografía y de análisis cuantitativo de los locales de los circuitos sinápticos de las neuronas corticales específicas inhibitorias.
Neuronas inhibidoras son cruciales para la función cortical. Que comprenden un 20% de toda la población de neuronas corticales y puede subdividirse en diversos subtipos sobre la base de sus propiedades inmunoquímicas, morfológicas, fisiológicas y 1-4. Aunque investigaciones previas han revelado mucho sobre las propiedades intrínsecas de los distintos tipos de neuronas inhibitorias, el conocimiento acerca de sus conexiones en el circuito local sigue siendo relativamente limitada 3,5,6. Teniendo en cuenta que la función de cada neurona individual está marcada por su entrada de excitación e inhibición sináptica dentro de los circuitos corticales, que hemos estado usando escaneo láser fotoestimulación (LSP) a las conexiones mapa del circuito local para tipos específicos de células inhibitorias. En comparación con la estimulación eléctrica convencional o la estimulación de hojaldre glutamato, LSP tiene ventajas únicas permitiendo para el mapeo de amplia y el análisis cuantitativo de los insumos locales funcionales registrados individualmente neuronas 3,7-9. Fotoestimulación con láser a través de uncaging glutamato activa selectivamente las neuronas perisomatically, sin necesidad de activar los axones de paso o dendritas distal, lo que garantiza una resolución de asignación de sub-laminar. La sensibilidad y la eficiencia de los proveedores de servicios lingüísticos para las entradas de mapeo de los sitios de estimulación muchos sobre una gran región son muy adecuadas para el análisis de circuitos corticales.
Aquí se introduce la técnica de la LSP en combinación con células enteras patch clamp para la asignación de locales del circuito inhibitorio. Grabaciones objetivo de tipos específicos de células inhibidoras se ven facilitadas por el uso de ratones transgénicos que expresan proteínas verde fluorescente (GFP) en poblaciones de neuronas inhibidoras limitan la corteza 3,10, lo que permite el muestreo constante de los tipos de células específicas y la identificación inequívoca de los tipos celulares registrados . En cuanto a la asignación de LSP, se describe la instrumentación del sistema, se describe el procedimiento experimental y de adquisición de datos, y se presentan ejemplos de los mapas del circuito en el ratón corteza somatosensorial primaria. Como se ilustra en nuestros experimentos, el glutamato enjaulados se activa en una región espacialmente restringida de los cortes de cerebro por fotólisis láser UV; simultánea fijación de voltaje, las grabaciones permiten la detección de fotoestimulación-evocó las respuestas sinápticas. Mapas de cualquiera de las entradas sinápticas excitadoras o inhibidoras de la neurona objetivo se generan mediante el escaneo del rayo láser para estimular a cientos de posibles sitios presináptica. Por lo tanto, LSP permite la construcción de mapas detallados de las entradas sinápticas que inciden en los tipos específicos de neuronas inhibitorias a través de repetidos experimentos. En conjunto, la técnica basada en la fotoestimulación ofrece neurocientíficos una herramienta poderosa para la determinación de la organización funcional de los circuitos corticales locales.
1. Cerebro rebanada preparación
2. Equipo de inicio
La implementación del sistema en general se ilustra en la Figura 1.
3. La creación de la perfusión rebanada
4. Patch-clamp de células enteras de grabación
5. Laser scanning fotoestimulación
6. Fotoestimulación de análisis de datos
Nuestra metodología de reciente desarrollo e implementación de software 11 se aplica a la detección y medida de fotoestimulación evocado acontecimientos sináptica en los mapas de los datos en bruto. Como se ejemplifica en la figura 2, un código de colores los mapas se construyen para ilustrar el patrón de entrada sináptica de las neuronas registradas.
7. Los resultados representativos:
Ejemplo de resultados de registro electrofisiológico y la cartografía de la fotoestimulación se muestran en la Figura 2. Grabaciones objetivo de tipos específicos de células inhibitorias son posibles mediante el uso de ratones transgénicos que expresan GFP en conocidos tipos de células inhibitorias. Dada la diversidad de las interneuronas inhibitorias, análisis de expresión de las buenas prácticas agrarias, la electrofisiología intrínseco y características morfológicas (Figura 2) se combinan para llegar a la clasificación de las células de tipo final. Figura 2B-C muestran que la fotoestimulación de escaneo láser permite la asignación de locales amplios conexiones del circuito cortical en un solo neuronas inhibidoras. El mapa de los datos en bruto se muestra en la Figura 2C. Las respuestas uncaging directos están excluidas de análisis de datos (Fig. 2C). Los mapas de entrada cuantitativos están codificados por colores, que se muestra en la Figura 2D-F. El ejemplo de rápido remate interneuronas inhibitorias recibió un fuerte entrada de excitación sináptica (EPSCs) de la capa 4 y las capas más profundas. Al relacionar la organización de la célula de la entrada sináptica a definir las vías corticales, que son capaces de inferir su posible papel (por ejemplo, la retroalimentación y la inhibición de feedforward) en el procesamiento de información cortical.
Figura 1. Instrumentación de sistema general de fotoestimulación de escaneo láser. Nuestro sistema general consiste en el control de la fotoestimulación, imágenes de video y sistemas de grabación electrofisiológica. Hemos aprobado el diseño del sistema de LSP se describió anteriormente 7,17. Una unidad de láser se utiliza para generar 355 nm láser ultravioleta para uncaging glutamato. El rayo láser se dirige a través de la trayectoria óptica de nuestro sistema. Corta duración de destellos láser (por ejemplo, 1 - 3 ms) son controlados por medio de un modulador electro-óptico (es decir, células Pockels) y un obturador mecánico. La potencia del láser de haz es modulada por una rueda de gradiente de densidad neutral y supervisado por la desviación de una pequeña fracción del haz de láser con un cubreobjetos de un fotodiodo. El sistema de escaneo láser incluye un par XY de los espejos de escaneo, la lente de escaneado, el lente del tubo, y la lente del objetivo. Los espejos de entregar el rayo láser a través de una lente de exploración, a continuación, el haz entra en el microscopio a través de un espejo dicroico y se centra por una lente de tubo a medida UV-transmisión. El haz bajo rellenos de la abertura posterior del objetivo del microscopio para proporcionar una más columnas (en lugar de cónicos), haz de iluminación, mantenimiento de la cartografía como de dos dimensiones como sea posible al reducir la resolución axial. Con arreglo al objetivo de 4x, el rayo láser forma manchas uncaging, cada approximating un perfil gaussiano con un ancho de 153 m lateralmente en el plano focal (ver recuadro). Varios puestos de la estimulación con láser se puede lograr a través de galvanómetros impulsada por los espejos de escaneo XY, como los espejos y la apertura posterior del objetivo están en planos conjugados, la traducción de las posiciones espejo en diferentes localizaciones de exploración en el plano focal de la lente objetivo. Durante uncaging, un número variable de páginas con dibujos que abarca todo el campo son estimulados de forma secuencial en un nonraster, secuencia aleatoria para evitar volver a visitar los alrededores de los sitios recientemente estimulada. Por favor refiérase a Xu et al. (2010) para obtener información más detallada.
Figura 2. Asignación de conexiones del circuito local de excitación a un expresan GFP rápido clavar las interneuronas de la capa 4 de la corteza sensorial primaria del ratón. A1 y A2 muestran la DIC y fluorescente GFP imágenes de la célula se prevé en el objetivo de 60x en la porción del cerebro que viven, mientras que muestra A3 la morfología de las células reveló mediante tinción biocitina en el post-registro, el tramo fijo. A4 muestra los patrones de descarga de la célula de las buenas prácticas agrarias registradas, característica de un interneuronas inhibitorias rápido remate, en respuesta a las inyecciones de intrasomatic actual de diferentes potencias. B mostrar la imagen de corte superpuestas con los 16 sitios de fotoestimulación x16 (*). La ubicación de la celda se indica por el pequeño círculo rojo. C muestra una serie de fotoestimulación evocado por los rastros de respuesta de las ubicaciones de la estimulación se muestra en la B, mientras que la célula se llevó a cabo a -70 mV para detectar las corrientes hacia el interior de excitación. Las diferentes formas de respuestas fotoestimulación se ilustran por las huellas en los lugares de 1 y 2, que se expanden y se muestran por separado en el inserto. La huella 1 es un ejemplo de las respuestas directas (indicado por las flechas rojas) para glutamato uncaging en el cuerpo celular y las dendritas promximal. Otras huellas en 2 son ejemplos típicos de las respuestas de excitación sináptica de entrada (azul). Respuestas directas y entradas sinápticas pueden ser distinguidos por sus amplitudes y las latencias de respuesta. D, E y F son los mapas codificados por color (16x16 sitios) de la media de EPSC amplitud, el número de EPSC, y la primera latencia detectado EPSC por sitio, respectivamente, para los datos en bruto mapa que se muestra en C. La amplitud media de entrada de cada lugar de estimulación es la amplitud media de EPSCs en la ventana de análisis, con la respuesta espontánea de referencia resta de la respuesta de la fotoestimulación del mismo sitio. El número de EPSCs y la hora de llegada o la latencia de la EPSC detectó por primera vez por el sitio también se miden y se representan. Por favor, consulte (Shi et al., 2010) para más detalles.
Fotoestimulación técnicas basadas en la cartografía han sido efectivamente aplicadas para el análisis de los circuitos corticales. Fotoestimulación de escaneo láser combinado con la grabación de células completas permite el mapeo de alta resolución de la distribución laminar de las fuentes de entrada presináptica de neuronas individuales, ya que el registro simultáneo de una neurona postsináptica con fotoestimulación de grupos de neuronas presinápticas en muchos lugares diferentes proporciona medidas cuan...
No hay conflictos de interés declarado.
Damos las gracias a Tran Huynh, Andrés San Antonio, Jerry Lin por su asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones DA023700 y DA023700 04S1-a XX
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
líneas transgénicas de ratón | Jackson de laboratorio o de otras fuentes | Por favor refiérase a Xu y Callaway (2009) | |
GFP gafas | BLS Ltd., Hungría | ||
vibratome | Leica | VT1200S | |
MNI enjaulados glutamato (4-metoxi-7-nitroindolinyl-jaula L-glutamato) | Bioscience Tocris, Ellisville, MO | No. Cat. 1490 | |
biocitina | B4261 | ||
electrodo extractor | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
tubos de vidrio para la fabricación de electrodos | BF150-86-10 | ||
MultiClamp amplificador 700B | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | MultiClamp 700B | |
digital de la cámara CCD | Q-imagen, Austin, TX | Retiga 2000 | |
Investigación microscopio | Olympus, Tokio, Japón | BW51X | |
Unidad láser UV | DPSS láser, Santa Clara, CA | modelo 3501 | |
Otros equipos para escaneo láser phostimulation | Por favor refiérase a Xu et al (2010). |
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