Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Resumen

Una forma rápida y asequible para extraer parásito calidad malaria y ADN del vector a partir de muestras de mosquitos se describe. Capitalizando en las propiedades quelantes de resina Chelex, el simple método permite el genotipado de parásitos de la malaria en mosquitos fases glándula del intestino medio y salivales, así como la identificación molecular de los Anopheles Entre hermanos especies por PCR.

Resumen

Los países endémicos están adoptando cada vez más herramientas moleculares para la tipificación eficiente, identificación y vigilancia contra parásitos de la malaria y los mosquitos vectores, como parte integral de sus programas de control de ^1,2,3,4,5. Para el establecimiento sostenible de estos enfoques precisos en las operaciones de investigación para fortalecer el control de la malaria y los esfuerzos de eliminación, métodos sencillos y asequibles, con el reactivo parsimonioso y requerimientos de equipo son esenciales ^6,7,8. Aquí les presentamos una sencilla técnica basada en Chelex para la extracción de parásito de la malaria y el ADN vector de muestras de campo mosquitos recolectados.

Hemos identificado morfológicamente 72 Anopheles gambiae sl. Desde 156 mosquitos capturados por piretro spray de capturas en los dormitorios de los hogares dentro de 2.000 km ² cerca del Instituto de Malaria en Macha. Después de la disección para separar la cabeza y el tórax del abdomen para todos los gam 72 AnophelesBIAE sl. mosquitos, las dos secciones se colocaron individualmente en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y se sumergieron en 20 l de agua desionizada. Utilizando una punta de pipeta estéril, cada sección de mosquito se homogeneizó por separado a una suspensión uniforme en el agua desionizada. Del homogeneizado resultante de cada sección de mosquito, 10 l se retuvo mientras que el otro 10 l se transfirió a un tubo esterilizado en autoclave por separado 1,5 ml. Las alícuotas separadas se sometieron a extracción de ADN ya sea por el Chelex simplificado estándar o la salazón a cabo la extracción protocolo de ^9,10. El protocolo de salificación es llamado y utilizado ampliamente debido a que emplea altas concentraciones de sal en lugar de disolventes orgánicos peligrosos (tales como fenol y cloroformo) para la etapa de precipitación de la proteína durante la extracción de ADN ^9.

Los extractos fueron utilizados como plantillas para la amplificación por PCR usando cebadores dirigidos artrópodo deshidrogenasa mitocondrial nicotinamida adenina dinucleótidonase (NADH) subunidad gen 4 (ND4) para comprobar la calidad del ADN ^11, una PCR para la identificación de las especies de Anopheles gambiae hermanos ^{de 10} y una PCR anidada para la tipificación de infección por Plasmodium falciparum ^12. La comparación con la calidad del ADN (ND4) PCR mostró 93% de sensibilidad y 82% especificidad para el enfoque Chelex en relación con lo establecido desalado protocolo. Los valores correspondientes de sensibilidad y especificidad fueron del 100% y 78%, respectivamente, utilizando hermano de identificación de especies PCR y 92% y 80%, respectivamente, para P. falciparum detección por PCR. No hubo diferencias significativas en la proporción de muestras en las que la señal de amplicón con el Chelex o el desplazamiento salino normal protocolo en las tres aplicaciones de la PCR. El enfoque Chelex requiere tres reactivos simples y 37 min en completarse, mientras que el. Desalado protocolo implicó 10 diferentes reactivos y 2 h 47 min y el tiempo de «tratamiento, incluyendo una etapa durante la noche Nuestros resultados muestran then el método de Chelex es comparable a la existente salazón a cabo la extracción y pueden estar sustituidos como un enfoque sencillo y sostenible en entornos con recursos limitados donde una cadena de suministro constante reactivo a menudo es difícil de mantener.

Protocolo

1. Disección Preparatoria de muestras de mosquitos

1. Lugar de mosquito en un pequeño corte de parafina y de montaje en microscopio de disección.
2. Cubrir en gota de agua desionizada para ablandar el tejido.
3. Incisión de la carcasa mosquito precisamente en la unión entre el tórax y el abdomen, por lo tanto mellar la cabeza y el tórax de la sección abdominal.
4. Transfiera cada sección mosquitos disecados en un lugar limpio autoclave 1,5 ml tubo de microcentrífuga prelabeled con mosquitos detalles de identificación de números y debidamente marcados para indicar la sección del cuerpo (por ejemplo, "m" para mediados de intestino sección; "ht" para la cabeza y el tórax sección).
5. Deseche parafilm y limpie cuidadosamente platina del microscopio con un 70% de alcohol humedecido Kimwipe antes de procesar el siguiente mosquito.

2. Extracción de ADN a partir de muestras de mosquitos

1. Pipetear 20 l de agua desionizada en un tubo de muestra y la punta de pipeta de uso para moler la sección de mosquito sumergido en una ONUsuspensión iform.
2. Añadir 100 l de autoclave 1X PBS / 1% de solución de saponina al homogeneizado de la muestra y mezclar mediante agitación suave momentánea.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
4. Centrifugar a 20.000 xg durante 2 min y desechar el sobrenadante.
5. Resuspender el sedimento en 100 l de 1X PBS.
6. Centrifugar de nuevo a 20.000 xg durante 2 min y desechar el sobrenadante.
7. Por agitación suave (5 segundos), se resuspende el precipitado en 75 l de agua desionizada estéril y 25 l de w / v 20% de suspensión de resina Chelex-100 en agua desionizada.
8. Pierce agujero en la tapa del tubo de muestra con aguja hipodérmica estéril 23G flameado en el quemador Bunsen.
9. Hervir suspensión de la muestra en un baño de agua sobre una rejilla flotante (o en bloque de calentamiento) durante 10 min.
10. Centrifugar a 20.000 xg, durante 1 min y la transferencia subsiguiente solución de ADN en el vial de almacenamiento prelabeled para su uso como plantilla en aplicaciones de la PCR.

3. La genotipificación Plasmodium falciparum y Anophelesspp. Identificación molecular

1. Añadir 2,5 l de extracto de ADN Chelex en 25 mu l reacciones de PCR para comprobar la calidad del ADN ^11, identificar las especies de Anopheles ¹⁰ y el genotipo P. falciparum ¹² del intestino medio y salival infecciones de la glándula.
2. Para maximizar el rendimiento del amplicón, especialmente para P. detección falciparum, 1,5 X incluyen albúmina de suero bovino (BSA) en el ensayo de PCR. La composición de reacción se recomienda la siguiente: (2,5 l plantilla, 0,25 cebadores mu M, cloruro de magnesio 1,5 mM, dNTPs 200 mu M, 1X tampón de PCR, BSA 1,5 X y 1.0U Taq ADN polimerasa, en 25 volúmenes mu l).
3. Para comprobar la calidad del ADN en extracto, amplificar la región de la deshidrogenasa mitocondrial de artrópodos dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH) subunidad 4 (ND4) gen (ND4FW cebadores [5'-GTD YAT TTA TGA CCT TTR AA-3 '] y ND4RV [5' -CTT CTT CAC EGC ADW CGT TC-3 ']; esperan que el producto 400 pb) ^11,13.
4. Para diferenciar Anopheles gambiae sl. especies hermanas (An. gambiae ss y An. arabiensis. solamente), amplificar región de acompañamiento SNPs en el espaciadoras intergénicas (IGS) región (primers de la ONU [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; esperar 390bp productos An. SS gambiae, 315bp An. arabiensis) ^10,11.
5. Para escribir P. falciparum antifolato polimorfismos de resistencia a fármacos, realizar la PCR anidada para amplificar la región flanqueante codones de aminoácidos 108, 51, 59, 16 y 164 en la dihidrofolato reductasa parásito (DHFR):
   Cebadores primarios redondas: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] y M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
   Secondary cebadores redondas: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] con F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
   O
   F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] con M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
   También amplificar la región que contiene los codones de aminoácidos 436, 437, 540, 581 aº 613 en la P. falciparum dihidropteroato sintetasa (DHPS) de genes:
   Primaria ronda primers R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] con R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
   Secundaria primers redondo
   J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] con K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
   O
   K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] con K /,
   O
   L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] con L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] ^12.
6. Tema 4 amplicón l a alelo-específicos digestiones de enzimas de restricción en 30 reacciones mu l siguiendo las instrucciones del fabricante, para detectar fármacos antifolato asociadas a la resistencia ¹² polimorfismos.
7. Tema 5 l de amplificación de PCR (o 15 l de digestión de restricción) por carril de etidio teñido con bromuro de 2% en gel de agarosa para electroforesis (100 - 120V) y visualizar las bandas con transiluminación UV.

Resultados

Los ejemplos de los resultados de los ensayos de PCR para la calidad del mosquito extracto de ADN (Figura 1), Anopheles arabiensis identificación molecular (Figura 2) y P. falciparum de detección (Figura 3) muestran que el método de Chelex simplificado produce resultados similares a la norma salificación protocolo ^10, a pesar de los pasos mucho menos (Tabla 1). Con una calidad de ADN comparable en los extractos respectivos, no es sorprendente que las tasas de muestra positividad con respecto a una. gambiae especies de hermanos, así como las tasas de infección por el parásito no fue estadísticamente diferente en función de chi-cuadrado de McNemar prueba (Figura 3).

Sensibilidad (%) se calculó como TP / (TP + FN) * 100, donde TP indica verdaderos positivos y falsos negativos FN marca. Especificidad (%) se determinó como TN / (TN + FP) * 100, donde TN indica un resultado negativo y FP denota falsos positivos. La calidad del ADN (ND4) PCR mostró 93% de sensibilidad y 82% especificidad para el enfoque Chelex en comparación con el protocolo establecido desalado como estándar de oro. Los valores correspondientes de sensibilidad y especificidad fueron del 100% y 78%, respectivamente, utilizando hermano de identificación de especies PCR y 92% y 80%, respectivamente, para P. falciparum detección por PCR.

La adición de BSA a las mezclas de reacción dio como resultado un aumento general de positivos de PCR (Figura 3) debido al alivio de los inhibidores de la PCR ^14, tanto para el Chelex simplificado y regular salificación protocolo. Sin embargo, este aumento no fue estadísticamente significativo, excepto para la calidad del ADN (PCR ND4) en extractos de Chelex (p = 0,039). El alelo-específica restricción de la digestión enzimática de la P. falciparum DHFR (o gen diana otro) amplicón permite el genotipado de las infecciones de malaria del intestino medio y de las glándulas salivales para los alelos de resistencia a fármacos (Figura 4, los datos de las glándulas salivales no se muestra).

Procedimiento simple Chelex		Estándar Ensanchamiento Procedimiento
Pasos	Reactivos	Pasos	Reactivos
Añadir la muestra a 1,5 ml tubo de microcentrífuga y se homogeneiza en 100 l de 1X PBS / 1% de solución de saponina (2 min). Dejar a temperatura ambiente durante 20 min. Girar a 20.000 xg durante 2 min y desechar el sobrenadante. Añadir 100 l de PBS 1X y mezclar suavemente por agitación momentánea (3 seg.) Girar a 20.000 xg durante 2 min y desechar el sobrenadante. Añadir 25 l de w / v Chelex 20% en agua desionizada y 75 l de agua desionizada estéril. Pierce agujero en la tapa del tubo de muestra usando una aguja caliente estéril hipodérmica 23G y el contenido del tubo ebullición durante 10 min. Derivado tubo de microcentrífuga a 20.000 xg durante 1 min. Transferir el sobrenadante en un vial estéril prelabeled y solución de ADN almacenar a -20 ° C hasta su uso (2,5 l en 25 l de reacción de PCR).	PBS La saponina Chelex-100 perlas	Añadir la muestra a 1,5 ml tubo de microcentrífuga y se homogeneiza en 100 * l tampón Bender con 1% DEPC (2 min). Incubar a 65 ° C durante 1 hr. Añadir 15 l de acetato de potasio frío 8 M. Mezclar suavemente e incubar en hielo durante 45 min. Derivado de muestra en tubos de microcentrífuga a 20.000 xg durante 10 min y Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo 1,5 ml. Añadir 250 l de etanol al 100% y mezclar bien invirtiendo el tubo. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 5 min. Girar las muestras a 20.000 xg durante 15 min. Aspirar y desechar el sobrenadante, dejando el precipitado se seque completamente en el tubo (30 men). Resuspender el sedimento en 20 l de 0,1 x SSC + RNAsa (10 mg / ml) durante la noche a 4 ° C. Añadir 80 l de agua DEPC y se almacena a -20 ° C hasta su uso.	Dietilpirocarbonato (DEPC) * Bender Buffer: 0,1 M NaCl 0,2 M de sacarosa 0,1 M Tris-HCL 0,05 M EDTA, pH 9,1 0,5% de SDS en agua DEPC 8 M de acetato de potasio Etanol 0,1 X citrato salino sódico (SSC) de amortiguación RNAsa (10 mg / ml)
TIEMPO TOTAL: 37 min		Tiempo total: 2 horas 47 minutos, y durante la noche

Tabla 1. Paso a paso comparación de los reactivos y el tiempo requerido para el protocolo Chelex simple y soportarard desalado método de extracción de ADN a partir de muestras de mosquitos.

Figura 1. ND4 mitocondrial PCR comparación de la calidad del ADN de Chelex simplificado "C" y estándar de precipitación salina "M" extractos de las muestras de Anopheles arabiensis de campo. NC, control negativo; M1 y C1, C2 y M2, M3 y C3, y C4 y M4 están emparejados desalado y extractos Chelex de un mismo. especímenes arabiensis mosquitos. L, escalera de 100 pb de ADN.

Figura 2 Molecular PCR para la identificación Anopheles arabiensis C1 y M1, M2 y C2, C3 y M3, M4 y C4 denotar amplicón correspondiente de la salazón a cabo "M" y simplificado Chelex "C" extractos de ADN de las muestras de mosquitos mismos;.. AR, Anopheles arabiensiscontrol positivo, L, escalera de 100 pb de ADN.

Figura 3. Detección de positivos en Chelex y desalado extractos de ADN de muestras de campo de mosquitos, con los ensayos de PCR para la identificación molecular de Anopheles arabiensis (AR) ^10, artrópodos genes NADH deshidrogenasa 4 (ND4) Prueba de ADN de calidad ^11, y P antifolato resistencia a los medicamentos . falciparum DHFR genotipado ¹² (F-M4). Los resultados mostrados para los ensayos se ejecutan con o sin BSA en la mezcla de reacción. Chi-cuadrado de McNemar se utilizó la prueba para determinar si las diferencias entre ciento de PCR positiva de ADN extraído de la Chelex simplificado y el estándar de precipitación salina protocolos fueron estadísticamente significativas.

Figura 4. Aplicación del protocolo simplificado Chelex en genotipificación P. infecciones por P. falciparum en los mosquitos (intestino medio muestran los datos) para los alelos de resistencia a fármacos. BstN I digestión de amplificación que flanquea el codón 108 del P. falciparum gen DHFR ¹² muestra cicloguanil mutantes resistentes S108T en muestras de mosquitos (M1-M5; del intestino medio se muestran los datos). U, sin digerir 522 pb de amplificación; FCR3, laboratorio estándar P. Falciparum clon control positivo llevar S108T, K1, P. falciparum laboratorio estándar de control clon negativo que lleva cicloguanil sensible S108N, L, escalera de 100 pb de ADN.

Discusión

El método de Chelex simplificada presentada aquí permite la extracción de la calidad Anopheles spp y P. falciparum ADN de las muestras de mosquitos susceptibles de diversas aplicaciones de la PCR. Esta técnica se puede emplear para la identificación molecular de los mosquitos vectores de la malaria y la vigilancia de resistente a los medicamentos P. alelos falciparum en los mosquitos para los programas nacionales de control de la malaria. Las ventajas de la técnica de Chelex simplificado incluyen la simplicidad, menos reactivos y, por tanto costo, seguridad y tiempo de procesamiento más corto (37 min) que los protocolos estándar tales como el método de precipitación salina ¹⁰ (2 hr 47 min y una etapa durante la noche, Tabla 1). Las ventajas antes mencionadas y los requisitos mínimos de reactivo (3 reactivos) en comparación con el actual protocolo estándar (10 reactivos, Tabla 1) ^11,15, que el protocolo Chelex simplificado particularmente amigable para los laboratorios del país endémicas donde un reactivo constantecadena de suministro es a menudo difícil de mantener. Una limitación de este método es que como el protocolo estándar, que fue también objeto de inhibidores de la PCR sabe que se producen en el integumento mosquito ^16. Sin embargo, esto es fácilmente aliviado por la inclusión de BSA en los ensayos. BSA también se ha empleado con éxito como un potenciador de la amplificación en contra de inhibidores en otras aplicaciones de la PCR ^17,18.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Chelex-100, 50-100 mesh seco	BioRad	# 143-2832
La saponina	SIGMA	142-7425
BSA	New England Biolabs	B9001S