A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Zusammenfassung

Eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, die Qualität Malariaparasiten und Vektor-DNA aus mosquito Proben zu extrahieren beschrieben. Aufbauend auf chelatisierenden Eigenschaften der Chelex Harz, ermöglicht die einfache Methode Genotypisierung von Malaria-Parasiten in Mücken Mitte Darm und Speicheldrüsen Phasen sowie molekulare Identifizierung der Anopheles Geschwister Spezies durch PCR.

Zusammenfassung

Endemischen Ländern übernehmen zunehmend molekulare Werkzeuge für die effiziente Typisierung, Identifizierung und Überwachung gegen Malariaparasiten und Vektor Mücken, als integralen Bestandteil ihrer Bekämpfungsprogramme ^1,2,3,4,5. Für eine nachhaltige Etablierung dieser genauen Ansätze in Operations Research zur Malaria-Kontrolle und Beseitigung Bemühungen, einfache und kostengünstige Methoden, mit sparsamen Reagenz und Anforderungen an die Ausrüstung zu stärken sind wesentliche ^6,7,8. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Chelex-basierte Technik zur Gewinnung von Malaria-Parasiten und Vektor-DNA aus dem Feld gesammelt mosquito Proben.

Wir morphologisch identifizierten 72 Anopheles gambiae sl. Von 156 Moskitos durch Pyrethrum Spray fängt in den Schlafräumen der Haushalte innerhalb eines 2.000 km ² Nähe des Malaria Institut Macha erfasst. Nach Dissektion, die Kopf und Thorax aus dem Bauch zu trennen für alle 72 Anopheles gambiae sl. Mücken, wurden die beiden Abschnitte einzeln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen platziert und untergetaucht in 20 ul entionisiertem Wasser. Verwendung einer sterilen Pipettenspitze wurde jeder Abschnitt separat Mücken zu einer gleichmäßigen Suspension in entionisiertem Wasser homogenisiert. Der anschließenden Homogenat aus jeder Mücke Abschnitt wurde 10 ul beibehalten, während die anderen 10 ul einer separaten autoklavierten 1,5 ml Röhrchen überführt wurde. Die separaten Aliquots wurden DNA-Extraktion entweder durch die vereinfachte Chelex oder die Standard Aussalzen Extraktionsprotokoll ^9,10 unterzogen. Das Protokoll ist Aussalzen sogenannte und weit verbreitet, weil sie hohe Salzkonzentrationen verwendet anstelle von gefährlichen organischen Lösungsmitteln (wie Phenol und Chloroform) für das Protein Fällungsschritt während der DNA-Extraktion ^9.

Extrakte wurden als Matrizen für die PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern verwendet Targeting Arthropoden mitochondrialen Nicotinamidadenindinucleotid Dehydrogenasenase (NADH) Untereinheit 4-Gen (ND4) an DNA-Qualität ^11, eine PCR zur ​​Identifizierung von Anopheles gambiae Geschwisterart ¹⁰ und eine verschachtelte PCR zur ​​Typisierung von Plasmodium falciparum-Infektion ¹² zu überprüfen. Vergleich mit DNA-Qualität (ND4) PCR zeigten 93% Sensitivität und 82% Spezifität für die Chelex Ansatz gegenüber der etablierten Aussalzen Protokoll. Entsprechende Werte von Sensitivität und Spezifität waren 100% bzw. 78%, jeweils unter Verwendung Geschwisterart Identifizierung PCR und 92% und 80%, jeweils für P. falciparum Nachweis PCR. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Anteil an Proben, bei Amplikon Signals mit der oder den regulären Chelex Aussalzen Protokoll über alle drei PCR-Anwendungen. Die Chelex Ansatz erforderlich drei einfachen Reagenzien und 37 min in Anspruch, während das Aussalzen Protokoll brachte 10 verschiedene Reagenzien und 2 h und 47 min 'Bearbeitungszeit, einschließlich einer Übernachtung Schritt. Unsere Ergebnisse zeigen, tham Chelex Verfahren ist vergleichbar mit der vorhandenen Aussalzen Extraktion und kann als eine einfache und nachhaltige Ansatz mit beschränkten Ressourcen wo eine konstante Reagenz Lieferkette ist oft schwierig zu warten substituiert sein.

Protokoll

Ein. Vorbereitende Präparation Mosquito Proben

1. Ort Mücke auf einem kleinen Schneiden von Parafilm und Halterung am Binokular.
2. Cover in Tropfen entionisiertes Wasser, um Gewebe zu erweichen.
3. Einzuschneiden die Mücke Karkasse genau an der Verbindungsstelle zwischen dem Thorax und Abdomen, damit Nicking den Kopf und Thorax von der abdominalen Abschnitt.
4. Übertragen Sie jede seziert mosquito Abschnitt in einem sauberen autoklaviert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Moskito-ID-Nummer Details und entsprechend gekennzeichnet, um Körper Abschnitt (zB "m" für Mitte-gut Abschnitt; "ht" für Kopf und Thorax-Bereich) bezeichnen prelabeled.
5. Entsorgen Parafilm und wischen Mikroskoptisch mit 70% Alkohol angefeuchtet Kimwipe vor der Verarbeitung der nächsten Mücke.

2. DNA Extraktion aus Mosquito Proben

1. Je 20 ul entionisiertem Wasser in Probenröhrchen und Pipettenspitze, die untergetaucht mosquito Abschnitt in eine un schleifeniform Suspension.
2. Fügen Sie 100 ul autoklaviertem 1X PBS / 1% Saponin Lösung Probenhomogenat und durch vorsichtiges momentanen Vortexen.
3. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min.
4. Zentrifuge bei 20.000 xg für 2 min und Überstand verwerfen.
5. Pellet in 100 ul 1X PBS.
6. Zentrifugieren bei 20.000 xg für 2 min und Überstand verwerfen.
7. Durch leichtes Vortexen (5 sec), Pellet in 75 ul sterilem entionisiertem Wasser und 25 ul 20% w / v Chelex-100 Harzsuspension in deionisiertem Wasser.
8. Pierce Loch im Deckel der Probenröhrchen mit sterilen 23G Injektionsnadel in Bunsenbrenner geflammt.
9. Boil Probensuspension im Wasserbad auf schwimmenden Zahnstange (oder im Heizblock) für 10 min.
10. Zentrifugieren bei 20.000 × g für 1 Min. und Übertragung anschließenden DNA-Lösung in prelabeled Lagervials zur Verwendung als Matrize in PCR-Anwendungen.

3. Plasmodium falciparum Genotypisierung und Anophelesspp. Molecular Identification

1. Fügen Sie 2,5 ul des Chelex DNA-Extrakt in 25 ul PCR Reaktionen auf DNA-Qualität ¹¹ kontrollieren, zu identifizieren Anopheles Arten ¹⁰ und dem Genotyp P. falciparum ¹² Mitte Darm und Speicheldrüsen Infektionen.
2. Um Amplikon Ertrag, vor allem für P. zu maximieren falciparum Detektion umfassen 1.5X Rinderserumalbumin (BSA) in dem PCR-Assay. Die folgende Reaktion Zusammensetzung wird empfohlen: (2,5 ul Vorlage, 0,25 pM Primer, 1,5 uM Magnesiumchlorid, 200 uM dNTPs, 1X PCR-Puffer, 1,5 X BSA und 1.0U Taq DNA-Polymerase, in 25 ul Volumen).
3. Um DNA-Qualität im Extrakt zu überprüfen, zu verstärken Region der Arthropoden mitochondrialen Nicotinamidadenindinucleotid Dehydrogenase (NADH)-Untereinheit 4 (ND4) Gen (Primer ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT ​​AA-3 '] und ND4RV [5' -CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 ']; erwarten Produkt 400bp) ^11,13.
4. Um Anopheles gambia differenzierene sl. Geschwisterart (An. gambiae ss und An. arabiensis only), verstärken flankierenden SNPs in der intergenen Spacer (IGS) Region (Primer UN [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; erwarten Produkt 390bp Ein gambiae ss, 315bp Ein arabiensis) ^10,11.
5. Für die Typisierung P. falciparum Antifolat Arzneimittelresistenz Polymorphismen, führen verschachtelten PCR zur ​​Region flankieren Aminosäurecodons 108, 51, 59, 16 und 164 in der Parasit Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen amplifizieren:
   Primäre Runde Primer: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] und M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
   Sekundäre Runde Primer: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] mit F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
   Oder
   F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] mit M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
   Auch verstärken enthaltenden Bereich Aminosäurecodons 436, 437, 540, 581 And 613 in der P. falciparum Dihydropteroat Synthetase (DHPS)-Gen:
   Primäre Runde Primer R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] mit R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
   Sekundäre Runde Primer
   J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] mit K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
   Oder
   K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] mit K /,
   Oder
   L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] mit L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] ^12.
6. Gegenstand 4 ul Amplikon zu allelspezifischen Restriktionsenzym Aufschlüsse in 30 ul Reaktionen nach den Anweisungen des Herstellers zum Aufspüren Antifolat Medikamentenresistenz-assoziierten Polymorphismen ^12.
7. Betreff 5 ul PCR Amplikon (oder 15 ul Restriktionsverdau) pro Spur von Ethidiumbromid-gefärbten 2% Agarosegel-Elektrophorese (100 - 120V) und visualisieren Banden unter UV Durchleuchtung.

Ergebnisse

Beispiele für Ergebnisse von PCR-Assays für Moskito DNA-Extrakt Qualität (Abbildung 1), Anopheles arabiensis molekulare Identifizierung (Abbildung 2) und P. falciparum-Erkennung (Abbildung 3) zeigen, dass die vereinfachte Chelex Verfahren zu ähnlichen Ergebnissen liefert der Standard Aussalzen Protokoll ^10, obwohl viel weniger Schritte (Tabelle 1). Bei vergleichbaren DNA-Qualität in den jeweiligen Extrakten ist es nicht verwunderlich, dass die Probe Positivität Preise in Bezug auf An. gambiae Geschwister Arten sowie Parasiten Infektionsraten waren statistisch nicht unterschiedlich basierend auf McNemar-Chi-Quadrat-Test (Abbildung 3).

Sensitivität (%) wurde berechnet als TP / (TP + FN) * 100, wo TP bezeichnet wahren Positiven und FN bezeichnet falsche Negative. Spezifität (%) wurde als TN / bestimmt (TN + FP) * 100, wo TN bezeichnet wahre Negative und FP bezeichnet Fehlalarme. Die DNA-Qualität (ND4) PCR zeigten 93% Sensitivität und 82% Spezifität für die Chelex Ansatz im Vergleich zu den etablierten Aussalzen Protokoll als Goldstandard. Entsprechende Werte von Sensitivität und Spezifität waren 100% bzw. 78%, jeweils unter Verwendung Geschwisterart Identifizierung PCR und 92% und 80%, jeweils für P. falciparum Nachweis PCR.

Der Zusatz von BSA an Reaktionsgemische ergab eine allgemeine Erhöhung der PCR Positives (3) infolge Entlastung der PCR-Inhibitoren ^14, sowohl für die vereinfachte Chelex und regelmäßige Aussalzen Protokoll. Allerdings war dieser Anstieg statistisch nicht signifikant mit Ausnahme von DNA-Qualität (ND4 PCR) auf Chelex Extrakte (p = 0,039). Allel-spezifische Restriktionsenzymverdau auf P. falciparum DHFR (oder andere Target-Gen) Amplikon ermöglicht die Genotypisierung von Mitte Darm und Speicheldrüse Malariainfektionen für Arzneimittelresistenz Allele (Fig. 4; Speicheldrüse Daten nicht gezeigt).

Einfache Chelex Procedure		Standard Aussalzen Procedure
Treppe	Reagenzien	Treppe	Reagenzien
Fügen Probe 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und homogenisieren in 100 ul 1X PBS / 1% Saponin-Lösung (2 min). Hinterlegen bei Raumtemperatur für 20 min. Spin bei 20.000 xg für 2 min und Überstand verwerfen. Fügen Sie 100 ul 1X PBS und vorsichtig mischen durch kurzes Vortexen (3 sec). Spin bei 20.000 xg für 2 min und Überstand verwerfen. Fügen Sie 25 ul 20% w / v Chelex in entionisiertem Wasser und 75 ul sterilem entionisiertem Wasser. Pierce Loch im Deckel des Probenröhrchens mit heißer, steriler 23G Injektionsnadel und Tubeninhalt Sieden für 10 min. Spin Mikrozentrifugenröhrchen bei 20000 × g für 1 min. Überstand in sterile prelabeled Fläschchen und store DNA-Lösung bei -20 ° C bis zur Verwendung (2,5 ul in 25 ul PCR-Reaktion).	PBS Saponin Chelex-100 Perlen	Hinzufügen Probe zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und homogenisieren in 100 ul Puffer Bender * mit 1% DEPC (2 min). Inkubieren bei 65 ° C für 1 Stunde. Fügen Sie 15 ul kalten 8 M Kaliumacetat. Vorsichtig mischen und auf Eis inkubieren für 45 min. Spin Probe in Mikrozentrifugenröhrchen bei 20.000 xg für 10 min und Transfer Überstand in ein neues 1,5 ml-Tube. Fügen Sie 250 ul 100% Ethanol und gut mischen durch Invertieren des Röhrchens. Inkubieren Probe bei RT 5 min. Spin Proben bei 20.000 × g für 15 min. Ansaugen und Überstand verwerfen, so dass das Pellet vollständig trocknen im Rohr (30 min). Pellet in 20 ul 0,1 X SSC + RNAse (10 ug / ml) über Nacht bei 4 ° C. Fügen Sie 80 ul DEPC Wasser und bei -20 ° C bis zur Verwendung.	Diethylpyrocarbonat (DEPC) * Bender Buffer: 0,1 M NaCl 0,2 M Sucrose 0,1 M Tris-HCL 0,05 M EDTA, pH 9,1 0,5% SDS in DEPC Wasser 8 M Kaliumacetat Ethanol 0,1 X Saline Natriumcitrat (SSC)-Puffer RNAse (10 ug / ml)
TOTAL TIME: 37 min		TOTAL TIME: 2 Std. 47 min, plus Nacht

Tabelle 1. Schritt Vergleich der Reagenzien und Zeitbedarf für einfache Chelex Protokoll Schritt und stehenard Aussalzen Methode zur DNA-Extraktion aus Moskito-Proben.

Abbildung 1. ND4 mitochondrialen PCR Vergleich der DNA-Qualität von vereinfachten Chelex "C" und Standard Aussalzen "M"-Extrakten auf Anopheles arabiensis Feldproben. NC, Negativkontrolle; M1 und C1, M2 und C2, C3 und M3 und M4 und C4 sind gepaart Aussalzen und Chelex Extrakte von gleichen An. arabiensis mosquito Proben. L, 100 bp DNA-Leiter.

Abbildung 2 Molecular Identifizierung PCR für Anopheles arabiensis C1 und M1, M2 und C2, C3 und M3 und M4 bedeuten C4 jeweiligen Amplikon aus Aussalzen "M" und vereinfacht Chelex "C" DNA Extrakte zur gleichen Moskito Proben;.. AR, Anopheles arabiensispositive Kontrolle; L, 100 bp DNA-Leiter.

Abbildung 3. Erkennung von Positive auf Chelex und Aussalzen DNA-Extrakte für Moskito Feldproben mit PCR-Assays für die molekulare Identifizierung von Anopheles arabiensis (AR) ^10, Arthropoden NADH-Dehydrogenase-Gen 4 (ND4) DNA Qualitätstest ¹¹ und Antifolat drug resistance P . falciparum DHFR Genotypisierung ¹² (F-M4). Ergebnisse bei Versuchen mit oder ohne BSA in der Reaktionsmischung ausgeführt dargestellt. McNemar-Chi-Quadrat-Test wurde verwendet, um festzustellen, ob die Unterschiede zwischen Prozent positive PCRs von DNA aus der vereinfachten Chelex extrahiert und die Standard Aussalzen Protokolle waren statistisch signifikant.

Abbildung 4. Anwendung des vereinfachten Chelex Protokoll Genotypisierung P. falciparum-Infektionen bei Mücken (mid-gut-Daten gezeigt) für Resistenz-Allele. BSTN I Verdauung auf Amplikon flankierenden Codon 108 des P. falciparum DHFR-Gen ¹² zeigt Cycloguanil-resistente Mutanten in Moskito S108T Proben (M1-M5; mittleres Darm Daten gezeigt). U, unverdaute 522 bp Amplikon; FCR3, Labor-Standard P. falciparum positive Kontrolle Klon trägt S108T; K1, P. falciparum Laborstandard Klon negative Kontrolle Durchführung Cycloguanil-sensitive S108N; L, 100 bp DNA-Leiter.

Diskussion

Die vereinfachte Chelex hier vorgestellte Methode ermöglicht die Extraktion der Qualität Anopheles spp und P. falciparum DNA aus Moskito-Proben zugänglich diverse PCR-Anwendungen. Diese Technik kann für die molekulare Identifizierung von Malariavektorkontrollschulung Mücken und Überwachung der Arzneimittel-resistente P. eingesetzt werden falciparum Allele in Mücken National Malaria Control Programs. Die Vorteile des vereinfachten Chelex Technik gehören Einfachheit, weniger Reagenzien und damit Kosten, Sicherheit und kürzere Bearbeitungszeiten (37 min) als Standard-Protokolle wie das Aussalzen Verfahren ¹⁰ (2 hr 47 min und einer Nacht Schritt, Tabelle 1). Die oben genannten Vorteile und minimale Reagenz Anforderungen (3 Reagenzien) auf den aktuellen Standard-Protokoll (10 Reagenzien, Tabelle 1) ^11,15 gegenüber, machen die vereinfachte Chelex Protokoll besonders freundlich zu endemischen Land Laboratorien, in denen eine konstante ReagenzSupply Chain ist es oft schwierig zu pflegen. Eine Beschränkung des Verfahrens ist, dass wie die Standard-Protokoll, auch war Gegenstand PCR-Inhibitoren bekannt, in der Mücke Integument ¹⁶ auftreten. Jedoch ist dies ohne weiteres durch Einschluß von BSA in den Assays erleichtert. BSA wurde auch erfolgreich als Verstärkung Enhancer gegen Inhibitoren in anderen PCR-Anwendungen ^17,18 beschäftigt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Chelex-100, 50-100 trockenen mesh	BioRad	# 143-2832
Saponin	SIGMA	142-7425
BSA	New England Biolabs	B9001S