Creación de fracturas rígidamente estabilizados para la evaluación de osificación intramembranosa, la distracción osteogénica, o la curación de los defectos críticos de tamaño

Resumen

Este artículo describe un método para estabilizar fracturas de huesos largos que se basa en la aplicación de modificados Ilizarov fijadores externos ^1-3. Después de la aplicación de los fijadores y la creación de la lesión ósea, la curación puede ser evaluada, la distracción osteogénica se puede realizar, o un defecto de tamaño no sindicalizados o crítica puede ser creado y utilizado para estudiar las intervenciones terapéuticas.

Resumen

La evaluación de los modos de reparación ósea es esencial para el desarrollo de terapias que se utilizan clínicamente para el tratamiento de las fracturas. La estabilidad mecánica juega un papel importante en la curación de las lesiones óseas. En el peor de los casos la inestabilidad mecánica puede llevar a los seres humanos con retraso o la no unión en el. Sin embargo, el movimiento también puede estimular el proceso de curación. En las fracturas que tienen formas de movimiento del cartílago para estabilizar los extremos de los huesos de fracturas, y este cartílago es reemplazado gradualmente por hueso a través de la recapitulación del proceso de desarrollo de la osificación endocondral. En contraste, si una fractura ósea está rígidamente estabilizado hueso se forma directamente a través de osificación intramembranosa. Clínicamente, tanto en la osificación endocondral y intramembranosa ocurren simultáneamente. Para replicar eficazmente este proceso los investigadores insertar una clavija en el canal medular del hueso fracturado como se describe por Bonnarens ^4. Este método experimental proporciona una estabilidad lateral excelente permitiendo al mismo tiempo rotational de persistir la inestabilidad. Sin embargo, nuestra comprensión de los mecanismos que regulan estos dos procesos distintos también se puede mejorar de forma experimental aislar cada uno de estos procesos. Hemos desarrollado un protocolo de estabilización que proporciona la estabilización de rotación y lateral. En este modelo, la osificación intramembranosa es el único modo de sanación que se observa y los parámetros de la curación se puede comparar entre diferentes cepas de ratones genéticamente modificados ^5-7, después de la aplicación de moléculas bioactivas ^8,9, después de la alteración de los parámetros fisiológicos de la cicatrización ^10, después de modificar la cantidad o el tiempo de estabilización ^11, después de distracción osteogénica ^12, después de la creación de una falta de unión ^13, o después de la creación de un defecto de tamaño crítico. Aquí, se ilustra la forma de aplicar el fijador de Ilizarov modificados para el estudio de la curación de fracturas de tibia y distracción ósea en ratones.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales de UCSF Institucional y el empleo Comisión y se ajustan a las directrices nacionales.

1. Preparación de los fijadores antes de la cirugía

1. Antes de crear una fractura estabilizada, es necesario montar el dispositivo de diseño personalizado de la fijación externa. Los marcos de fijación especialmente diseñados externos consta de dos anillos de aluminio estabilizados por tres de acero inoxidable # 0/56 varillas roscadas, 8 # 2/56 tuercas hexagonales y 17 tornillos a juego (Pequeña Parte Inc., de Miami Lakes, FL ^3).
2. Dos anillos de aluminio se necesitan por fractura. Para montar un anillo de 4 º 2/56 tuercas hexagonales (pequeña pieza Inc., de Miami Lakes, FL) y los pernos que coinciden en los agujeros correspondientes, éstos deben quedar sueltos. Este será el anillo proximal. Para montar el anillo distal 3 tuercas y tornillos, una vez más no apriete por completo.

2. Anestesia, fractura la Creación, y la aplicación del fijador

1. Los ratones (edad, sexo, y el cuerpopeso se determinó por el usuario) se anestesiaron por inyección intraperitoneal de 50mg/ml ketamina, 0,5 mg / ml de medetomidina (0,03 ml / ratón).
2. Aplicar lubricante ocular para los ojos de los ratones y colocar un pedazo de cinta adhesiva en su cabeza para proteger sus ojos durante el procedimiento.
3. El animal se coloca sobre una almohadilla de calentamiento durante el resto del procedimiento.
4. Transfix las metáfisis proximal y distal de la tibia izquierda por medio de cuatro pernos 0,25 mm de los insectos estériles (Anticorro: Tool Science Fine, Foster City, CA), uniendo los pines a una herramienta de Dremel y la perforación a través del hueso.
5. Pasadores están orientadas perpendicularmente al eje longitudinal de la tibia, y 90 ° entre sí. Al menos 10 mm entre los pasadores proximal y distal.
6. Coloque el primer anillo por encima de los pernos proximales con las tuercas hacia adentro, hacia las patillas. Asegure los pasadores para el anillo de mantenimiento de la tibia posición central dentro del anillo de aluminio.
7. Coloque el segundo anillo por debajo de la dipines Stal y asegurar los pasadores para el anillo con las tuercas hexagonales, como antes. Añadir la cuarta tuerca de perno en combinación para la parte distal del fijador.
8. Crear la fractura transversal por tres puntos de flexión con un dispositivo adecuado. Utilizamos el sistema de gravedad de Bonnarens Einhorn y ^4. Coloque la superficie posterolateral de la tibia a través de los bloques, aumentar el peso a una altura predeterminada a lo largo del brazo de la gota y dejar caer el peso de modo que entra en contacto con la cara anterolateral de la tibia para producir la fractura contundente. La altura del peso se deja caer desde necesita ser determinado para cada cepa de ratón para asegurar una fractura solo exclusivamente de la tibia.
9. Fractura se confirma por rayos-X.
10. Después de confirmar la fractura, tres de acero inoxidable # 0/56 varillas roscadas están unidos a los anillos. Comenzando desde el extremo distal insertar la varilla y enhebrar una tuerca en el anillo distal para bloquear la barra. A continuación, dicho de otra tuerca en la varilla, el anillo proximal se sentará en la parte superior de esta nut. Asegúrese de que los dos anillos se llevará a cabo a la misma distancia y no forzar las clavijas. Fijar el anillo proximal a las barras con una tuerca tercero.
11. Las inyecciones subcutáneas de buprenorfina (1,0 mg / kg) para la analgesia se administró inmediatamente después de la cirugía y los animales se vigilan para el dolor y la buprenorfina dado, según sea necesario.
12. La anestesia se revierte mediante la administración de atipamezol, y los animales son monitoreados hasta que son sensibles y deambular.

3. Osteogénesis por distracción (ver también: ^12,13)

Para modificar este procedimiento para dar cabida a distracción osteogénica es sencillo. Los anillos se mantienen en posición por varillas roscadas, y girando las tuercas que sujetan las varillas en su lugar los anillos se pueden mover de separación.

1. Latencia: Para la distracción osteogénica estándar de uso de este modelo de los fijadores se colocan en la tibia y se fue solo por un período de latencia de 5 días.
2. Distracción: osteog distracciónENESIS puede llevarse a cabo girando las tuercas de las barras estabilizadoras de giro de ¼ (0,25 mm) cada día 7 días.
3. Maduración: Bony puente se observa en 10 días y la consolidación completa se observa por 27 días después de la finalización de distracción.

4. Creación de un defecto crítico Empresas

Para crear un defecto de tamaño crítico los fijadores externos se aplican como se ha descrito anteriormente con las siguientes modificaciones.

1. Antes de comenzar el procedimiento de la piel se limpia con un 70% de etanol.
2. Los fijadores se aplican completamente antes de crear el defecto.
3. El ratón se coloque bajo el microscopio de disección para visualizar la tibia medial y una incisión (5-7 mm) se hace con una cuchilla # 10 en un bisturí.
4. El músculo se secciona suavemente y separados para exponer la mitad de diáfisis de la tibia.
5. Un segmento de 3 mm del hueso se retira entonces de la tijera mediados de diáfisis utilizando. Uso de tque señalar de las tijeras, el hueso se cortó lentamente lejos y fragmentos de hueso se eliminan con pinzas si es necesario. Se debe tener cuidado con las puntas de las tijeras para evitar el desplazamiento de la tibia con una gran fuerza mecánica.
6. Examinar el sitio quirúrgico para asegurar que no existen fragmentos de hueso, ya que podrían promover la curación.
7. Vuelva a colocar el músculo alrededor de los extremos romos de la tibia.
8. Cierre de la incisión en la piel con 2-3 suturas de monofilamento de poliaminas 6-0.
9. La anestesia se invierte y los animales control se elegirán para el dolor y dado analgésicos como se describió previamente.

5. Los resultados representativos

Cuando se aplica correctamente, los fijadores externos proporcionan una mayor estabilidad rígida de la fractura cerrada de tibia con una excelente reducción (Figuras 1, 2). Sin embargo, en algunos casos la reducción inadecuada (una diferencia obvia y grande entre los extremos de los huesos o fracturas múltiples se producen (Fig. 3 ), Y estos ratones se excluyen de los análisis. Las fracturas estabilizado utilizando este método curar principalmente a través de osificación intramembranosa (fig. 4). En contraste, si la fractura no se estabiliza un callo grande cartílago está formado en el hueco de la fractura (fig. 5), y este es sustituido por hueso a través del proceso de osificación intramembranosa.

Figura 1. Radiografías que ilustran un dispositivo de fijación externo que se utiliza para estabilizar una fractura tibial. Radiografía tomada después de la fractura que muestra algunos de los segmentos óseos bien alineados (punta de flecha).

Figura 2. Imagen de un ratón después el fijador se ha aplicado.

Figura 3. Radiografía tomada después de la fracture muestra los segmentos de hueso desalineado y fragmentado (punta de flecha).

Figura 4. Fractura estabilizada a través de cura osificación intramembranosa. Tinción tricrómica de fractura estabilizada muestra un poco de hueso nuevo (b) en el sitio de fractura. Barras de escala = 500 micras.

Figura 5. No estabilizado fractura se cura a través de la osificación endocondral. Tinción tricrómica de fractura no estabilizada muestra cartílago (c) y hueso (b) en lugar de la fractura. Barras de escala = 500 micras.

Discusión

Los huesos se curan en dos modalidades diferentes en función de la estabilidad mecánica (revisado en ^14). Cuando se deja que se forme una gran inestabilidad de la plantilla del cartílago en la línea de fractura que es reemplazado por hueso para cubrir los dos extremos del hueso roto. Proximal y distal a la rotura, el hueso se forma directamente por la osificación intramembranosa en el periostio y endostio. En contraste, en la curación de fracturas estable se produce exclusivamente a través de osificaci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pasador de insectos 0,25 mm	Herramienta de Ciencias de Bellas	26000-25	Acero oscuras anodizado, 0,25 mm diámetro de la varilla, la longitud de 4 cm
De acero inoxidable Tuerca hexagonal	Piezas pequeñas	# 2-56	1/8 "de longitud, 56 hilos por pulgada
De acero inoxidable Tuerca hexagonal	Piezas pequeñas	# 0-80	1/8 "de longitud, 80 hilos por pulgada
Tornillo de acero inoxidable de la máquina	Piezas pequeñas	# 0-80	1/8 "de longitud, 80 hilos por pulgada
Máquina de acero inoxidable Corte de varillas roscadas	Piezas pequeñas	# 0-80	6 "de largo, 80 hilos por pulgada
18-8 de acero inoxidable Machine Head Screw	McMaster-Carr		Temas 2-56, 3/6 "de largo
Dispositivo de fijación externa	Taller de máquinas	Diseño personalizado