Determinación del recuento de células de mamíferos, el tamaño celular y la salud de la célula mediante el Moxi Z Mini contador automatizado de células

Resumen

El Moxi Z contador automático de células en miniatura es un instrumento novedoso que combina el Principio Coulter con la tecnología patentada de sensor de película delgada y un algoritmo de software propietario para realizar el dimensionado y el recuento de un amplio rango de tamaño de partículas, así como para determinar el estado general de salud de monodispersas cultivos de células de mamíferos. Este protocolo se describe el uso de este instrumento para contar y evaluar la salud de los cultivos celulares.

Resumen

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls^1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques⁶.

Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.

The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.

Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

Protocolo

1. Preparación de las muestras

1. Diluir la suspensión de células con ORFLO diluyente o un diluyente adecuado para que la concentración de células se encuentra dentro del rango de operación del instrumento (3.000 a 500.000 células / ml para Tipo casete M, o de 3.000 a 2.500.000 células / ml para casete Tipo S).
2. Una dilución de 1:5 a 1:20 (tipo cassette M) o ninguna dilución a 1:05 de dilución (cassette de tipo S) se recomienda para la mayoría de las líneas celulares de mamíferos, pero la dilución adecuada dependerá del tipo de célula y la densidad de siembra. El volumen requerido para un conteo exacto es de aproximadamente 75 l.

2. Las muestras de manejo de

1. Gire a la Z Moxi pulsando el botón de encendido y la pantalla de inicio se mostrará.
2. Presione la bandeja hacia abajo e inserte un videocasete en la Z. Moxi La muestra con una pipeta 75μL ... Se mostrará la pantalla.
3. Pipetear una muestra de 75 l en el puerto de llenado de la cinta (óvalo azulmarcado 1 o 2, dependiendo de qué extremo del casete se inserta en el instrumento). Estas son las casetes desechables, que pueden ser utilizados para las pruebas 2. Nota: Coloque la punta de la pipeta directamente en la carga así a ~ 45 ° ángulo de modo que la punta está atrapado bajo el labio delantero del pozo. Cuando la dispensación, es importante que el vacío no "salir adelante" de la dispensación del líquido como podría causar bolsillos de aire entre en la cassette. Se recomienda tener una pequeña gota (el tamaño de entrada así) de forma fluida sobre el pozo durante la dispensación.
4. Para el recuento de células de mamíferos más, toque la pantalla en cualquier lugar para empezar. Para la cuantificación de partículas muy pequeñas (de 4 a 8 micras de diámetro promedio de tipo M y 3-8 micras de diámetro promedio de tipo S), el Z Moxi se puede ejecutar en modo de pequeñas partículas. Nota: el tipo de casete está indicado en la barra de negro en la parte superior de la pantalla. En este modo, Moxi Z establece la escala diámetro de 2 a 10 micras como el valor predeterminado y que realiza el recuento ucantar parámetros optimizados para la detección de células pequeñas. Pulse el botón de CONTACTO AQUÍ Pequeña modo de partículas (el cuadrado negro) para iniciar la prueba y se ejecutan en este modo.
5. El Z Moxi comenzará la prueba y los resultados del conteo de células se completará en aproximadamente 8 segundos (tipo casete M) o 15 segundos (cassette de tipo S).
6. El ajuste de curvas y cálculos MVI comenzará de forma automática y requiere sólo unos segundos adicionales. Cuando un ajuste adecuado se encuentra, los resultados entonces automáticamente se visualiza en la pantalla.
7. Para que el modo de adquisición de apertura de puerta por defecto, presione la curva de ajuste para activar el botón Cuenta en el modo de apertura de puerta.
8. En este punto la casete puede ser retirado de la unidad.

3. Gestión de datos

1. Si la escala sección AutoMode está apagado, los resultados se muestran inicialmente para un recuento de ajuste de la curva en una escala de 2-34 micras de diámetro (tipo cassette M) o 2-26 μm (cassette de tipo S). Si el escalado Automode está activado, entonces el Z Moxi automáticamente la escala del eje horizontal (eje x) para el rango que está más cerca de la anchura de la población curva de ajuste asegurando al mismo tiempo todos los datos de ajuste de curva se muestra.
2. Si la escala sección AutoMode está apagado, para mostrar de forma manual los resultados en una resolución más alta, toque el icono de 2.26 micras (tipo M) o el icono de 2.18 micras (tipo S). Nota: El tipo de casete se indica en el cuadro azul en la parte superior izquierda de la pantalla. Esto se recomienda cuando contando células más pequeñas o partículas para mejorar tanto las capacidades de ajuste de curvas, así como la capacidad del usuario para discriminar visualmente matices de los datos.
3. Al aumentar la resolución horizontal, el botón de escala dinámicamente ajustar para permitir el ciclismo entre los rangos de escala disponibles eje x: 2-34, 2-26, 2-18 y 2-10 micras para el cassette de tipo M, o 2 -26, 2-18, y 2-10 micras de casete Tipo S. Esta función sólo está disponicable bifilar inmediatamente después de un recuento de células.
4. Contar información (células / ml) para el ajuste de curva cerrada o región se muestra en un recuadro negro bajo el lado izquierdo del histograma. El tamaño medio de información de la célula se muestra en el recuadro negro bajo el lado derecho del histograma.
5. El valor monetario se muestra un cuadro azul en la parte superior derecha del histograma. Si la prueba se ejecute en modo de pequeña partícula, el MVI no se aplica y se mostrará como "MVI = SPM". Además, si la concentración de células se encuentra fuera del rango de operación MVI, un mensaje de "MVI = Fuera de rango" en la pantalla.
6. Para guardar el histograma actual, toque en el icono de Hecho. Esto guarda los datos con el nombre de "Prueba de XXX" donde XXX es el número de prueba correspondiente.
7. Para manualmente la puerta del histograma, toque para cambiar el ajuste de curva recuento de los resultados de botón. Esto hace que el modo de adquisición de apertura de puerta por defecto. A continuación, deslice cada marcador de puerta azul para configurar las puertas o toque ºflechas e izquierdo y derecho (aparecen al tocar el marcador de puerta azul) para los ajustes finos de puerta Sólo las células entre los marcadores se cuentan. La escala vertical del histograma se escala automáticamente sobre la base de la amplitud de la población de la curva de ajuste. Para ajustar la escala vertical, deslizar la pantalla hacia arriba o hacia abajo en la región del histograma.
8. Pulse el botón de Cuenta cerrada resultados para devolver la pantalla al modo de ajuste de la curva y que el modo de ajuste de la curva por defecto el modo de adquisición.
9. A continuación, pulse el icono de Listo para guardar los resultados y volver a la pantalla de inicio. Para eliminar los resultados, presione el icono de eliminar en cualquier momento para eliminar permanentemente los resultados de la prueba.

4. Análisis de los datos adquiridos con anterioridad

1. Para abrir una prueba de guardado, pulse el icono de histograma en la pantalla de inicio.
2. Los iconos de hasta nueve histogramas guardados se mostrarán en la pantalla.Pulse el icono apropiado para la prueba de interés o presione la página o hacia abajo los iconos para ver más resultados de la prueba.
3. Cada histograma se abrió, ya sea en el modo de curva de ajuste o el modo de Conde Conde cerrada, dependiendo de cómo se salvó. En el modo de Conde cerrada, los marcadores de activación periódica se puede colocar como desee deslizando cada marcador de puerta azul de forma independiente. Puerta automática al tocar en la cima deseada. Toque para alternar entre el conde cerrada y los modos de ajuste de la curva Conde.
4. Pulse los iconos de zoom y Unzoom para ajustar la escala vertical del histograma. La escala vertical también se puede cambiar verticalmente deslizando un dedo sobre la pantalla de arriba (para aumentar) o hacia abajo (para disminuir).
5. Pulse el icono Eliminar para eliminar permanentemente los resultados de la prueba.
6. Pulse el icono de Listo paracerca de los resultados de la prueba y volver a la pantalla de inicio. (Nota: La vista ampliada no se guardarán.)

5. Transferencia de datos a un PC

1. Los datos pueden transferirse a un PC utilizando la aplicación Moxichart Orflo oa través de transferencia USB conectando el Moxi Z cable USB a un PC o Mac. Para la transferencia de Bluetooth (MoxiChart), en primer lugar determinar el ID de la unidad Bluetooth pulsando en el icono de Bluetooth en la pantalla de inicio de la unidad de Moxi Z.
2. En el ordenador, abra la aplicación MoxiChart y haga clic en el icono Bluetooth en la esquina superior derecha. A continuación, seleccione el dispositivo que corresponde a la identificación de Bluetooth de la Z Moxi y seleccione una carpeta de destino para los archivos subidos.
3. Moxichart se transferirá automáticamente todos los archivos en el directorio especificado a través de la conexión Bluetooth.
4. Los archivos transferidos a través de Bluetooth (MoxiChart) o USB se puede abrir y análisiszado directamente con la aplicación MoxiChart o, debido a que tienen el formato. csv, se pueden abrir directamente en Microsoft Excel u otros programas de análisis de datos para el análisis, además, / personalizado.

6. Los resultados representativos

Para evaluar la precisión y la exactitud de la Z Moxi, los conteos de células HEK-293, células HeLa, CHO-K1, levadura, Jurkat E6-1 células, las células PC12, y de precisión calibrados suspensiones de cuentas, con concentraciones que van desde las células 0-500,000 / ml (Tipo casete M) y 0-2-2.5e ⁶ células / ml (casete Tipo S) se contaron y se compararon mediante un Z2 Coulter y la Z. Moxi Todas las células de mamífero se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivó como se ha descrito anteriormente ^7-11. Brevemente, las células fueron cultivadas en suspensión en 75 mm ² frascos de cultivo de tejidos con medios de base de medio RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), las células del MEM (HEK-293, HeLa), o F12K (CHO-K1) células. Todos los medios se complementó con10% de suero fetal bovino y 100 U penicillin/100 estreptomicina g. Los matraces se mantuvieron en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO _2. Las células se pasaron cada 3 días. Las células de levadura (X5, C. albicans, Vin 13) fueron donados y utilizados de inmediato conforme a lo dispuesto. Las concentraciones iniciales de muestra de ~ 500.000 células / ml para los datos de casetes Tipo M y ~ 2-2.5E ⁶ células / ml para el cassette del Type S se establecieron mediante el Z2 Coulter. Posteriores niveles de concentración teóricos se prepararon mediante diluciones seriadas con tampones fisiológicos (Isoton II o solución salina equilibrada de Hank). En cada concentración, muestras idénticas se midieron por ambos sistemas y se traza una contra la otra. Como se observa en la Figura 2, se produjo una fuerte correlación lineal (Tipo M r ^2> 0,9886, tipo S r ^2> 0,9781) entre los recuentos de todas las muestras. Las concentraciones también se compararon con las concentraciones de células esperados / teórica tanto con la Z y Z2 de la Moxi ( Figura 3) y volvió a demostrar correlaciones lineales fuertes (tipo M r ^2> 0,9758, tipo S r ^2> 0,9774).

Para evaluar la precisión, HEK-293 y el recuento de células HeLa se realizaron con el Z2 Coulter, Moxi Z, y un hemocitómetro. El coeficiente de variación (CV, n = 19) de los recuentos de células utilizando el Moxi Z (tipo cassette M), Z2 Coulter y un hemocitómetro se calcularon con la CV se mide a partir de 5 cuentas separadas en las 200.000-300.000 células por ml de rango. El pequeño CV medio (Figura 4) de la Z Moxi es comparable a la de la Z2 y es representativa de la alto nivel de precisión sólo alcanzable con Coulter tecnologías basadas en recuento.

Dimensionamiento de la precisión del instrumento Moxi Z se evaluó la siguiente a través de la medición de los comprados, esferas de poliestireno de precisión calibrados. Valores medios de tamaño de partícula (n = 5) de Moxi Z se representaron frente tamaños fabricante reportados. Como puede verse in la figura 5, las medidas de Moxi Z siempre coincide con los valores del fabricante con una alta correlación lineal (r ² = 0,9989).

Más allá del tamaño y la información recuento, Moxi Z proporciona un reactivo libre, la evaluación general de salud cultivo celular de mamífero con un índice de viabilidad informó Moxi (MVI) valor. Este índice se genera a partir de una relación entre el número de células en la población de interés con respecto a los recuentos totales de partículas. Para demostrar las capacidades de medición de MVI, las lecturas de MVI (tipo cassette M) en comparación con el manual de normas y de citometría de flujo en vivo / muerto técnicas de medición. Las poblaciones de los muertos (<10% viable) HEK-293 y las células HeLa fueron creados a través de las incubaciones durante la noche de las células vivas en un fluoruro de sodio en nutrientes libre, que contiene el diluyente (Isoton II, Beckman Coulter) a 37 ° C. Controlar los niveles de viabilidad teórica fueron preparados por ratiometrically concentraciones conocidas de la mezcla de células vivas y muertas. Res.ulting soluciones fueron analizadas para niveles de viabilidad por duplicado con los recuentos de ambos hemocitómetro y las mediciones del citómetro de flujo. Mediciones hemocitómetro se hicieron usando una tradicional mezcla 50/50 de 0,1% de solución azul de tripano y las células. Mediciones de citometría de flujo se hicieron usando un citómetro de Guayaba PCA (Merck) utilizando el reactivo Viacount y el fabricante especifica-protocolo (Merck). Como se muestra en la Figura 6, los valores de correlación de Pearson (R ²⁾ "del ajuste lineal de los datos MVI a análogos porcentajes hemocitómetro viabilidad para" células HEK y células HeLa fueron de r ² = 0,9937 y ² r = 0,9728, respectivamente. Estos resultados demuestran que este enfoque proporciona información de referencia cultural de la salud a través de una amplia gama de viabilidades celulares que se comparan favorablemente con las mediciones en vivo / muerto obtenidos mediante un citómetro de flujo o un hemocitómetro.

Tablas y Figuras (De Dittami et al, 2011). ^15:

Figura 1. De película delgada Conteo Coulter: La corriente eléctrica pasa a través de la Zona de la célula de detección de la casete de película delgada. Como las células fluir único archivo a través de la CSZ, los aumentos momentáneos de voltaje se miden por el Z. Moxi

Figura 2. Moxi recuentos Z son comparables a Coulter Z2 recuentos. Recuentos idénticas de suspensiones de células y el talón se contaron usando tanto un Z2 Coulter y la Z. Moxi Promediado valores de recuento (n = 3-4) de los recuentos de Moxi Z se representan con respecto a la Coulter Z2 correspondientes cuentas y valores de r ² del ajuste lineal se determinaron. A) Tipo M casete - intervalo de concentración de 0 - 500.000 células / ml. B) Tipo de cassette S - rango de concentración de 0 - 2-2.5E ^{6 /} Bares ml.Error indican ± 1 desviación estándar.

Figura 3. Moxi mediciones de concentración de Z vs concentraciones teóricas de células. A) Tipo de cassette M - Los valores teóricos de concentración fueron preparados a partir de diluciones seriadas de una cantidad inicial de 500.000 células / ml de muestra B) Tipo S de cassette -. Los valores teóricos de concentración fueron preparados a partir de diluciones seriadas de un inicial 2 - 2.5E ⁶ células / ml de muestra. Barras de error indican ± 1 desviación estándar.

Figura 4. Coeficiente de variación para el Z2 Coulter, Moxi Z (tipo cassette M), y el hemocitómetro. El coeficiente de variación (CV, n = 19) de HEK-293 y el recuento de células HeLa para cada método se calcularon con CV medidos a partir de 5 por separado cargos de HEK-293 y las células HeLa en el 200.000 - 300.000 células por ml de rango. Barras de error indican ± 1 desviación estándar.

Figura 5. La precisión de las mediciones de tamaño de partícula usando Moxi Z-Moxi Z mide el tamaño de grano (tipo cassette M) vs fabricante informó de tamaño de las perlas. Barras de error indican ± 1 desviación estándar.

Figura 6. Cultura Evaluación de la Salud con MVI - Comparación de las mediciones de MVI (tipo cassette M) y la viabilidad de Guayaba PCA Viacount frente visuales, del azul tripán cuenta la viabilidad teñidas utilizando un hemocitómetro.

Discusión

La aplicación del enfoque subyacente Coulter pueden ser altamente determinista de la precisión global de las mediciones. Un área crítica es la corrección de los recuentos de células primas para "eventos coincidencia" donde dos o más células simultáneamente pasan a través de la abertura y se mide como un evento eléctrico único. "Eventos coincidencia" contribuir a un error que varía en función de un número de factores incluyendo el tamaño celular y el grado de agrupamiento (Davis et al 1967) ^6. Como resultado, la corrección de coincidencia necesaria para cualquier muestra dada no se puede predecir, variando ampliamente entre tipos de células / partícula e incluso entre diferentes culturas de tipos de células idénticas. Establecido teoría, basada en las publicaciones iniciales por Coulter, consiste en aplicar un ajuste logarítmica de los recuentos primas basadas en el número de eventos observados y una determinada empíricamente, de partícula específica del factor de corrección, z. Si bien el número exacto puede ser realizado con la tel algoritmo de corrección, se limita en su aplicación práctica, debido a las grandes variaciones en los valores de z entre tipos de células y la correspondiente dificultad en predecir con exactitud su valor. Aquí, utilizando la "verdadera" recuento de células identificadas por el ajuste de la curva Moxi Z en conjunción con el algoritmo de corrección de coincidencia, el Z Moxi dinámicamente corrige coincidencia para alcanzar las concentraciones reales. En comparación con los resultados obtenidos con alta gama Coulter Z2, el Z Moxi cuenta comparables producidas a través de un rango de concentración de 0 a 500.000 células / ml (tipo cassette M) y 3000 - 2-2.5E ⁶ células / ml (cassette de tipo S) . Además, el Z Moxi logra esta precisión recuento con un coeficiente bajo similar de variación en los recuentos y una precisión en partículas de tamaño que es característico del patrón oro, Coulter-técnica en el recuento de células.

Por otra parte, los datos presentados aquí indican que la Z Moxi pueden proporcionar información valiosacon respecto a la salud general de los cultivos celulares. El Z Moxi aprovecha el enfoque de ajuste de curvas con un algoritmo de software propietario para determinar esta evaluación de seguridad y salud. Los cambios morfológicos asociados con la muerte celular, como blebbing, separándose y distorsiones volumétricas (Kataoka y Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) ^12-14, hacen posible que el Moxi-Z para distinguir las diferencias entre los impedimetric viven las poblaciones y las poblaciones de células muertas / escombros. El valor monetario es generado por el análisis de la distribución del tamaño de la cultura / partícula para identificar las contribuciones relativas de partículas de desechos, reducidos células necróticas, y la curva de la población equipada célula de interés. El valor MVI lo refleja un índice de población o medida radiométrica de los recuentos de población monodispersas con respecto al perfil de partícula población general. Este valor se hace mediante algoritmos ajustados en función de las estadísticas basadas en la población y las observaciones empíricas. Because la MVI mira a otros parámetros que los enfoques de tinción tradicionales, no se espera para duplicar estas técnicas sino que proporciona una vista alternativa valiosa en la salud de un cultivo de células, particularmente con respecto a los restos y contaminantes microbianos.

En resumen, el contador de células Moxi-Z es un instrumento de ultra sobremesa pequeño que proporciona ensayos precisas y reproducibles de recuento de células, el tamaño de celda, y la salud de células utilizando el Principio Coulter y de ajuste de curvas algoritmos de software combinada con una tecnología de sensores patentada de película delgada . Con el cassette de tipo M es capaz de contar partículas que van desde 4 - 25 micras de diámetro (rango dinámico de 2 - 34 micras), en 8 segundos. Con el casete Tipo S es capaz de contar partículas que van desde 3 - 20 micras de diámetro (rango dinámico de 2 - 26 micras), en 15 segundos. Además, el Moxi-Z lleva a cabo evaluaciones de salud sin el uso de reactivos. Es inte mucho menos trabajonsive y subjetivos que el recuento manual. En comparación con la norma recuento Coulter, la Moxi es más rápido, significativamente menor, proporciona más información, requiere un mantenimiento considerablemente menor, es más fácil de usar, y es una fracción del coste.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ORFLO diluyente	ORFLO	MXA006
Casete dispensador	ORFLO		Almacena hasta 25 casetes para una cómoda dosificación
Cable USB	ORFLO		Conecta instrumento para PC / Mac o adaptador de corriente
Adaptador de corriente (modelos de Estados Unidos y la Unión Europea solamente)	ORFLO		Conecta el cable USB a una toma de CA
USB Flash Drive	ORFLO		Tiendas Moxi Z de software y manual del usuario
Cuentas Calibration Check	ORFLO
Cassette de calibración electrónica	ORFLO		Cassette de electrónica para verificar el funcionamiento correcto del sistema y de calibración