Determinação da contagem de células de mamíferos, tamanho de célula e Saúde célula usando o Moxi Z Mini contador de células automatizado

Resumo

O Moxi Z miniatura contador de células automático é um novo instrumento que combina o princípio Coulter com a tecnologia de sensor patenteado de película fina e um algoritmo de software proprietário para executar dimensionamento e contagem de uma ampla gama de tamanho de partículas, bem como para determinar a saúde geral do monodispersos mamíferos culturas de células. Este protocolo descreve a utilização deste instrumento para contagem e avaliação da saúde das culturas de células.

Resumo

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls^1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques⁶.

Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.

The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.

Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

Protocolo

1. Preparação de Amostras

1. Dilui-se a suspensão de células com ORFLO diluente ou um diluente apropriado, de modo que a concentração de células está dentro da gama de funcionamento do instrumento (3.000 a 500.000 células / mL para Tipo cassete M, ou 3.000 a 2.500.000 células / mL para cassete Tipo S).
2. Uma diluição de 1:5 a 1:20 (Tipo cassete M) ou não de diluição a 1:5 de diluição (cassete de Tipo S) é recomendado para linhas de células de mamífero mais, mas uma diluição adequada dependerá do tipo de célula ea densidade de semeadura. O volume necessário para uma contagem exacta é de cerca de 75 uL.

2. Amostras em execução

1. Vire a Z Moxi pressionando o botão de energia ea tela inicial será exibida.
2. Pressione a bandeja para baixo e insira uma cassete no Z. Moxi O Pipetar 75μL de amostra ... tela será exibida.
3. Pipetar uma amostra de 75 uL na porta de preenchimento do cassete (oval azulidentificada como 1 ou 2, dependendo de qual final da cassete foi inserido no instrumento). Estes são cassetes descartáveis, que podem ser utilizados para 2 testes. Nota: Coloque a ponta da pipeta directamente para o carregamento bem a ~ 45 ° de ângulo de modo que a ponta é capturado sob o lábio frontal do poço. Quando dispensar, é importante que o vácuo não "chegar à frente» da distribuição do fluido, como poderia causar bolsas de ar para introduzir a cassete. Recomenda-se a ter um grânulo pequeno (o tamanho de entrada poço) de forma fluida sobre o poço durante a distribuição.
4. Para a contagem de células de mamíferos mais, toque na tela em qualquer lugar para começar. Para contagem de partículas muito pequenas (4 a 8 mM diâmetro médio de Tipo M e 3-8 mM diâmetro médio para o Tipo S), o Z Moxi pode ser executado no modo de partícula pequena. Nota: o tipo cassete é indicado na barra preta na parte superior da tela. Neste modo, Moxi Z define a escala de diâmetro de 2 a 10 uM como o padrão e executa a contagem de ucantar parâmetros otimizados para a detecção de pequenas células. Pressione o botão Modo TOQUE AQUI Pequenas partículas (quadrado preto) para iniciar o teste e executar neste modo.
5. O Z Moxi começará o teste e os resultados da contagem de células estará completa em aproximadamente 8 segundos (cassete de tipo M) ou 15 segundos (cassete de Tipo S).
6. O ajuste de curvas e cálculos MVI começar automaticamente e requerem apenas alguns segundos adicionais. Quando um ajuste adequado é encontrado, os resultados será então automaticamente no ecrã.
7. Para fazer Gating o modo de aquisição padrão, pressione o botão Curve Fit Conde para alternar para o modo de aquisição electrónica.
8. Neste ponto, a cassete pode ser removido da unidade.

3. Gerenciando dados

1. Se a escala AutoMode está desligado, os resultados são exibidos inicialmente para uma contagem de curva em uma escala de 2-34 mM diâmetro (tipo cassete M) ou 2-26 μm (cassete Tipo S). Se a escala Automode está ligado, em seguida, o Z Moxi automaticamente dimensionar o eixo horizontal (eixo x) para o intervalo que é mais próxima da largura da população curva de ajuste assegurando ao mesmo tempo de todos os dados da curva de ajuste é exibido.
2. Se a escala AutoMode está desligado, para exibir manualmente os resultados em uma resolução maior, toque no ícone mM 2-26 (Tipo M) ou o ícone mM 2-18 (tipo S). Nota: O tipo cassete é indicado na caixa de azul na parte superior esquerda da tela. Isto é recomendado quando a contagem de células menores ou partículas de melhorar as capacidades de ajuste de curvas, bem como a capacidade do usuário para discriminar visualmente nuances dos dados.
3. Ao aumentar a resolução horizontal, o botão de escala vai ajustar dinamicamente para permitir a bicicleta entre as faixas disponíveis para o eixo x escala: 2-34, 2-26, 2-18 e 2-10 M para a cassete Tipo M, ou 2 -26, 2-18, e 2-10 mm para a cassete de Tipo S. Esta funcionalidade só está dispoble imediatamente após uma contagem de células.
4. Contar as informações (células / ml) para a curva de ajuste de uma região ou gated é exibida numa caixa preta sob o lado esquerdo do histograma. Informações de tamanho significa célula é exibida na caixa preta sob o lado direito do histograma.
5. O valor MVI é exibida uma caixa azul na parte superior direita do histograma. Se o teste foi executado em modo de partícula pequena, o MVI não se aplica e será exibido como "MVI = SPM". Além disso, se a concentração de células está fora da gama de funcionamento MVI, uma mensagem de "MVI = fora do intervalo" será exibida.
6. Para salvar o histograma atual, toque no ícone Feito. Isto salva os dados com o nome de "Test XXX" onde XXX é o número de teste correspondente.
7. Para manualmente a porta do histograma, toque para alternar o Curve Fit contagem botão resultados. Isso faz com que Gating o modo de aquisição padrão. Em seguida, deslize cada marcador gating azul para definir as portas ou toque ªsetas de e esquerda e direita (estes aparecem ao tocar o marcador gating azul) para ajustes finos portão Somente as células entre os marcadores são contados. A escala de histograma vertical é ajustada automaticamente com base na amplitude população ajuste de curva. Para ajustar essa escala vertical, passe a tela para cima ou para baixo na região do histograma.
8. Toque no botão Gated Conde resultados para voltar a exibição para o modo de ajuste de curva e fazer modo de ajuste de curva padrão o modo de aquisição.
9. Em seguida, pressione o ícone Feito para salvar os resultados e voltar à tela inicial. Para excluir os resultados, pressione o ícone Excluir a qualquer momento para excluir permanentemente os resultados do teste.

4. Análise dos dados adquiridos previamente

1. Para abrir um teste salvo, pressione o ícone Histograma na tela inicial.
2. Ícones para até nove histogramas salvos será exibida na tela.Pressione o ícone apropriado para o teste de interesse ou pressione o Page Up ou Page Down ícones para ver mais resultados do teste.
3. Cada histograma será aberto tanto no modo de contagem Curve Fit ou modo Contagem Gated, dependendo de como ele foi salvo. No modo de contagem Gated, marcadores gating pode ser posicionada conforme desejado, deslizando cada marcador gating azul de forma independente. Portão automático por tocar no pico desejado. Toque para alternar entre o Conde Gated e modos de Contagem Curve Fit.
4. Pressione os ícones de zoom e desfazer o zoom para ajustar a escala vertical do histograma. A escala vertical também pode ser alterado pelo verticalmente, passando o dedo sobre a tela para cima (para aumentar) ou para baixo (para diminuir).
5. Pressione o ícone Excluir para excluir permanentemente os resultados do teste.
6. Pressione o ícone Feito parafechar os resultados do teste e retornar à tela inicial. (Nota: visão ampliada não será salvo.)

5. Transferindo Dados para um PC

1. Os dados podem ser transferidos para um PC usando o aplicativo Moxichart Orflo ou através de transferência USB, ligando o Moxi Z cabo USB a um PC ou Mac. Para transferência Bluetooth (MoxiChart), primeiro determinar o ID da unidade Bluetooth pressionando o ícone Bluetooth na tela inicial da unidade Z Moxi.
2. No computador, abra o aplicativo MoxiChart e clique no ícone Bluetooth no canto superior direito. Em seguida, escolha o dispositivo que corresponde à identificação de Bluetooth do Z Moxi e selecione uma pasta de destino para os arquivos enviados.
3. Moxichart irá transferir automaticamente todos os arquivos para o diretório especificado por meio da conexão Bluetooth.
4. Arquivos transferidos por Bluetooth (MoxiChart) ou USB pode ser aberto e análisezed diretamente com o aplicativo ou MoxiChart, porque elas são formatadas. csv, que pode ser diretamente aberto no Microsoft Excel ou outros programas de análise de dados para análise adicionalmente / custom.

6. Os resultados representativos

Para avaliar a precisão e exactidão do Z Moxi, as contagens de células HEK-293, células HeLa, CHO-K1, leveduras, Jurkat E6-1 células, as células PC12, e precisão-calibrada suspensões grânulo com concentrações que variam de 0-500,000 células / mL (Tipo cassete M) e 0-2-2.5e ⁶ células / ml (cassete de Tipo S) foram contadas e comparadas usando um Coulter Z2 e Z. Moxi Todas as células de mamíferos foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas como descrito anteriormente ^7-11. Resumidamente, as células foram cultivadas em suspensão em 75 mm ² frascos de cultura de tecidos com meios essenciais de RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), (HEK-293, HeLa) MEM células, ou F12K (CHO-K1) células. Todos os meios foram suplementados com10% de soro fetal de bovino e 100 U Estreptomicina ug penicillin/100. Os frascos foram mantidos em estufa a 37 ° C com 5% de CO _2. As células foram passadas a cada 3 dias. Células de levedura (X5, C. albicans, Vin 13) foram doadas e utilizadas imediatamente, tal como previsto. As concentrações amostra inicial de ~ de 500.000 células / mL para o tipo de dados M cassete e ~ 2-2.5e ⁶ células / ml para a cassete de Tipo S foram estabelecidos utilizando o Z2 Coulter. Subsequentes níveis de concentração teóricos foram preparados através de diluições em série, com tampões fisiológicos (Isoton II ou Solução Salina Equilibrada de Hank). Para cada concentração, amostras idênticas foram medidos por ambos os sistemas e traçada contra o outro. Como visto na Figura 2, houve uma forte correlação linear (Tipo M r ^2> 0,9886, Tipo S r ^2> 0,9781) entre as contagens para todas as amostras. As concentrações foram também comparadas com as concentrações esperadas / teórico de células com ambos o Z Moxi eo Z2 ( Figura 3) e, novamente, demonstrou forte correlação linear (Tipo M r ^2> 0,9758, Type S r ^2> 0,9774).

Para avaliar a precisão, HEK-293 e as contagens de células HeLa foram realizadas utilizando o Z2 Coulter, Moxi Z, e um hemocitómetro. O coeficiente médio de variação (CV, n = 19) das contagens de células utilizando o Z Moxi (Tipo cassete M), Coulter Z2 e um hemocitómetro foram calculados com CV é medido a partir de 5 contagens separadas nos 200.000-300.000 células / intervalo ml. O pequeno média CV (Figura 4) do Z Moxi é comparável à do Z2 e é representativo do nível elevado de precisão apenas atingível com Coulter tecnologias baseadas contagem.

Dimensionamento de precisão do instrumento foi avaliada Z Moxi próximo através da medição de precisão adquiridos, esferas de poliestireno calibrados. Medições de partículas de tamanho médios (n = 5) de Moxi Z foram plotadas contra os tamanhos fabricante relatados. Como pode ser visto in Figura 5, as medições Moxi Z emparelhado consistentemente os valores fabricante, com uma alta correlação linear (r ² = 0,9989).

Além do tamanho e informações de contagem, Moxi Z fornece um reagente sem avaliação geral de saúde de mamíferos em cultura celular com um índice relatado Viabilidade Moxi (MVI) valor. Este índice é gerada a partir de uma relação entre o número de células na população de interesse em relação às contagens de partículas totais. Para demonstrar as capacidades de medição MVI, leituras MVI (tipo cassete M) foram comparados com manual padrão e citometria de fluxo técnicas ao vivo / morto de medição. As populações de morto (<10% viável) HEK-293 e as células HeLa foram criados através de incubações durante a noite das células vivas em um fluoreto de sódio em nutrientes livre, contendo diluente (Isoton II, Beckman Coulter) a 37 ° C. Controlados os níveis de viabilidade teóricas foram preparadas por mistura ratiometrically concentrações conhecidas de células vivas e mortas. Ressoluções ulting foram analisadas para os níveis de viabilidade em duplicado com contagens de ambos os hemocitômetro e medições citómetro de fluxo. Medições foram feitas utilizando hemocitómetro uma mistura 50/50 tradicional de 0,1% solução de azul de tripano e as células. Medições de citometria de fluxo foram feitas usando um citómetro de goiaba PCA (Merck), utilizando o reagente Viacount eo fabricante-especificado protocolo (Merck). Como mostrado na Figura 6, os valores de correlação de Pearson coeficiente (r ²⁾ "do ajustamento linear dos dados MVI a percentagens hemocitômetro análogos de viabilidade de células HEK" e células HeLa foram r ² = 0,9937 ^e R2 = 0,9728, respectivamente. Estes resultados demonstram que esta abordagem proporciona informação sobre a saúde cultura através de uma ampla gama de viabilidade de células que se comparam favoravelmente com as medições vivos / mortos obtidos utilizando um citómetro de fluxo ou hemocitómetro.

Tabelas e Figuras (De Dittami et al, 2011.) ^15:

Figura 1. De película fina de contagem Coulter: A corrente eléctrica é passada através da zona da célula de detecção da cassete de película fina. Como células de fluxo único ficheiro através da CSZ, os aumentos na tensão momentâneas são medidos pelo Z. Moxi

Figura 2. Contagens Moxi Z são comparáveis ​​a Coulter Z2 contagens. Contagens idênticas de suspensões de células e talão foram contadas utilizando tanto um Z2 Coulter ea Z. Moxi Média de valores de contagem (n = 3-4) das contagens de Moxi Z foram traçados em relação à Coulter correspondentes Z2 contagens e valores de R ² do ajuste linear foram determinados. A) Tipo cassete M - intervalo de concentração de 0 - 500.000 células / ml. B) cassete Tipo S - faixa de concentração de 0 - 2-2.5e ⁶ / Bares ml.Error indicam ± 1 desvio padrão.

Figura 3. Medições de concentração vs Moxi Z concentrações celulares teóricos. A) Tipo cassete M - valores concentração teórica foram preparados a partir de diluições em série de um período inicial de 500.000 células / ml de amostra B) Tipo S cassete -. Valores concentração teórica foram preparados a partir de diluições em série de uma 2 - inicial 2.5e ⁶ células / ml de amostra. Barras de erro indicam ± desvio padrão 1.

Figura 4. Coeficiente de variação para o Z2 Coulter, Z Moxi (Tipo cassete M), e hemocitómetro. O coeficiente médio de variação (CV, n = 19) de HEK-293 e as contagens de células HeLa para cada abordagem foram calculados com CV medidos a partir de 5 separado contagens de HEK-293 e células HeLa no 200.000 - 300.000 células / ml alcance. Barras de erro indicam ± desvio padrão 1.

Figura 5. Precisão das medições de tamanho de partículas usando Moxi Z-Moxi Z mediram o tamanho do grânulo (cassetes M) vs fabricante informou tamanho das partículas. Barras de erro indicam ± desvio padrão 1.

Figura 6. Avaliação da Cultura Saúde usando MVI - Comparação entre medidas de MVI (cassetes M) e PCA Goiaba viabilidade Viacount contra visuais, azul-tripan contagens de viabilidade coradas utilizando um hemocitômetro.

Discussão

A implementação subjacente a abordagem Coulter pode ser altamente determinista da precisão global das medições. Uma área crítica é a correcção das contagens de células-primas para os eventos "coincidência" em que dois ou mais células simultaneamente passar através da abertura e são medidos como um único evento eléctrica. "Eventos coincidência" contribuir para erro que varia dependendo de um número de factores, incluindo o tamanho da célula e do grau de aglomeração (Davis et al 1967) ^6. Como resultado, a correcção coincidência necessária para uma dada amostra não pode ser previsto, variando amplamente entre células / partícula tipos e mesmo entre diferentes culturas de tipos de células idênticas. Estabelecido teoria, enraizada em publicações iniciais por Coulter, envolve a aplicação de um ajustamento logarítmica das contagens-primas com base no número de eventos observados e uma empiricamente-determinado, factor de correcção de partícula específico, z. Enquanto as contagens precisas podem ser adequadamente conseguido com to seu algoritmo de correcção, é limitada na sua aplicabilidade prática devido aos grandes variações nos valores de Z entre tipos de células e à dificuldade correspondente em prever com precisão o seu valor. Aqui, utilizando a contagem de células "verdadeiro" identificado pelo ajuste de curva Moxi Z em conjunto com o algoritmo de correcção de coincidência, o Z Moxi dinamicamente corrige para coincidência para atingir as concentrações reais. Quando comparados com os resultados obtidos usando alta final Coulter Z2, o Z Moxi produzido contagens comparáveis ​​em toda uma gama de concentrações de 0 - 500.000 células / ml (Tipo cassete M) e 3000 - 2-2.5e ⁶ células / ml (cassete de Tipo S) . Além disso, o Z Moxi alcança esta precisão de contagem com um coeficiente de variação semelhante baixo em contagens e uma precisão de dimensionamento de partículas que é característica de o padrão de ouro, Coulter-técnica na contagem de células.

Além disso, os dados aqui apresentados indicam que o Z Moxi pode fornecer informação valiosasobre a saúde geral das culturas de células. O Z Moxi utiliza a abordagem de ajuste de curva com um algoritmo de software proprietário para determinar essa avaliação saúde, cultura. As alterações morfológicas associadas com a morte das células, tais como blebbing, quebrando e distorções volumétricos (Kataoka e Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) ^12-14, tornam possível para o Moxi-Z para distinguir diferenças entre impedimetric vivem populações e mortos celulares / detritos populações. O MVI é gerada através da análise da distribuição de tamanho de cultura / partícula para identificar as contribuições relativas de detritos de partícula, encolhido células necróticas, ea curva equipada população de células de interesse. O valor assim MVI reflecte um índice de população ou medida raciométrica das contagens da população monodispersas com respeito ao perfil global de partícula população. Este valor é então algoritmicamente-ajustados estatísticas de base populacional e observações empíricas. BecausE o MVI olha para outros parâmetros do que as abordagens de coloração tradicionais, não é esperado para espelhar estas técnicas, mas em vez disso proporciona uma vista alternativa valiosa para a saúde de uma cultura de células, particularmente no que diz respeito à detritos e contaminantes microbianos.

Em resumo, o contador de células Moxi-Z é um instrumento de bancada ultra pequeno que proporciona precisas, ensaios reprodutíveis de contagem de células, tamanho da célula, e saúde célula usando o princípio Coulter e os algoritmos de ajuste de curvas de software combinado com uma tecnologia de sensor patenteado de película fina . Com a cassete de Tipo M é capaz de contagem de partículas que variam de 4 - 25 mícrons de diâmetro (gama dinâmica de 2 - 34 microns), em 8 segundos. Com a cassete de Tipo S é capaz de contagem de partículas que variam de 3 - 20 mícrons de diâmetro (gama dinâmica de 2 - 26 microns), em 15 segundos. Além disso, a Moxi-Z executa avaliações de saúde sem o uso de reagentes. É inte muito menos trabalhocaras e subjetiva que a contagem manual. Em comparação com a norma contagem Coulter, o Moxi é mais rápido, significativamente menor, fornece mais informações, requer uma manutenção consideravelmente menos, é mais fácil de usar, e é uma fracção do custo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
ORFLO Diluente	ORFLO	MXA006
Dispenser Cassete	ORFLO		Armazena até 25 cassetes para distribuição conveniente
Cabo USB	ORFLO		Conexão ao PC / Mac ou adaptador de energia
Power Adapter (EUA e da UE apenas alguns modelos)	ORFLO		Conecta cabo USB a uma tomada AC
USB Flash Drive	ORFLO		Lojas Moxi Z software e manual do usuário
Verifique Esferas de calibração	ORFLO
Cassete Calibração Eletrônica	ORFLO		Cassete eletrônico para verificar funcionamento adequado do sistema e calibração