Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio

Resumen

Un método para cargar subventricular (SVZ de zona) células con colorantes indicadores de calcio para el registro de la actividad de calcio se describe. El postnatal SVZ contiene células apretadas, incluyendo las células progenitoras neurales y neuroblastos. En lugar de utilizar carga baño se inyecta el medio de contraste por la presión en el interior del tejido que permite una mejor difusión de tinte.

Resumen

La zona subventricular (SVZ) es una de las dos zonas neurogénica en el cerebro postnatal. El SVZ contiene células densamente empaquetados, incluyendo las células progenitoras neuronales con características astrocytic (llamadas astrocitos SVZ), neuroblastos y células progenitoras intermedios. Neuroblastos nacidos en la SVZ tangencialmente emigrar a una gran distancia hasta el bulbo olfatorio, donde se diferencian en interneuronas. La señalización intercelular a través de moléculas de adhesión y señales difusibles juegan papeles importantes en la neurogénesis de control. Muchas de estas señales de desencadenar la actividad del calcio intercelular que transmite la información dentro y entre las células. La actividad del calcio es por lo tanto un reflejo de la actividad de señales extracelulares y es una forma óptima de comprender la señalización intercelular entre las células funcionales SVZ.

Actividad calcio ha sido estudiado en muchas otras regiones y tipos de células, incluyendo los astrocitos y neuronas maduras. Sin embargo, el método tradicional para loacélulas D con tinte indicador de calcio (es decir, la carga baño) no fue eficaz en la carga de todos los tipos de células SVZ. En efecto, la densidad celular en la SVZ se opone a la difusión del colorante en el interior del tejido. Además, la preparación de cortes sagitales mejor preservará la disposición tridimensional de las células SVZ, en particular la secuencia de la migración de neuroblastos en el eje rostral caudal.

A continuación, se describen métodos para preparar las secciones sagitales que contienen la SVZ, la carga de las células SVZ con tinte indicador de calcio, y la adquisición de la actividad del calcio con películas de time-lapse. Se utilizó Fluo-4 a.m. colorante para la carga de los astrocitos SVZ utilizando la aplicación de presión en el interior del tejido. La actividad del calcio fue grabado usando un microscopio confocal de barrido que permite una resolución precisa para distinguir las células individuales. Nuestro enfoque es aplicable a otras zonas neurogénicas incluyendo el hipocampo adulto zona subgranular y embrionarias zonas neurogénicos. Además, otros tipos de tintes puedeaplicarse utilizando el método descrito.

Protocolo

1. Preparación de las soluciones, disección y Vibratome

1. Las soluciones deben ser preparados en la osmolaridad y el pH correcto (Tabla 1). En comparación con fluido cerebroespinal artificial (ACSF), solución de disección se prepara con concentraciones menores de sodio y calcio, y mayores concentraciones de magnesio. Esto es para minimizar los efectos de excitotoxicidad durante el rebanado.
2. Ambas soluciones de disección y ACSF debe ser saturado con 95% O _2/5% CO ₂ mediante burbujeo durante al menos 10 min para alcanzar el pH deseado de 7,3.
3. Preparar un baño de hielo en una bandeja. Colocar una placa de disección en el baño de hielo y llene con la solución de disección. Burbuja de la placa de disección.
4. Preparar la vibratome mediante la creación de un baño de hielo. Colocar el plato de seccionamiento en el baño de hielo, llenar el recipiente con solución de disección, y la burbuja.
5. Llene la cámara de retención con rodaja ACSF y burbuja para asegurar que la solución está adecuadamente aireados sinde donde se colocan las rebanadas.

2. La eliminación del tejido cerebral

Rebanadas cerebrales agudos tienden a ser más saludables con ratones más jóvenes. La arquitectura celular SVZ postnatal en los roedores es madura alrededor del día postnatal (P) 20 ^1. Por lo tanto, tratamos de limitar los experimentos a las edades de ratón de P20-P30, pero hemos realizado experimentos con éxito en ratones tan antiguas como 3 meses. A lo largo de la manipulación del tejido, uno debe tener en cuenta para minimizar los movimientos mecánicos y la presión en el cerebro, mantener condiciones refrigeradas, y exponer la SVZ de solución lo más rápidamente posible sacrificio siguiente.

1. Después de la inyección de pentobarbital, el ratón se decapitaron rápidamente. La piel se retira y las incisiones se realizan a través de la base del cráneo. La cabeza se coloca entonces en una bandeja llena con solución de disección.
2. Si bien la estabilización de la cabeza con unas pinzas, cortes continuos se realizan en todo el cráneo y en ocasiones hasta la línea media con microscissors. Tener cuidado para minimizar el contacto con el tejido. Desde el bulbo olfativo es el destino final de las neuronas recién nacidas de la SVZ, uno debe ser consciente de la preservación de esa región, especialmente en la eliminación de hueso alrededor de esta área. Microscissor cortes realizados alrededor del cráneo debe estar en el lado dorsal, para permitir una fácil retirada del cráneo.
3. La eliminación del cráneo que cubre el cerebro ahora está separado de los huesos debajo del cerebro. Si los recortes en el paso anterior se hizo correctamente, este hueso suprayacente se puede quitar fácilmente con unas pinzas o fórceps.
4. Mientras sostiene la cabeza con fórceps, se puede utilizar una cuchilla quirúrgica para eliminar limpiamente varias piezas de tejido cerebral antes de rebanar, tales como las siguientes. Un corte coronal se pueden hacer en el nivel de lambda. Cortes sagitales se puede hacer en ambos lados del cerebro lateral a la SVZ. Una estimación conservadora sería de aproximadamente 2,5 mm de la línea media. Si se desea, el cerebro también puede hemiseccionaron aquí. Estos recortes tanto facilitar montaje del tejido y permitir que la SVZ a ser alcanzado más rápidamente cuando el cerebro de rebanar. Es importante recordar que debe ejercer la mínima cantidad de fuerzas mecánicas en el cerebro (por ejemplo, no empuje o tracción).

3. Cerebral agudo Preparación Slice

1. Para prepararse para etapas posteriores, asegurarse de que el pegamento utilizado para montar el tejido está libre de obstrucciones y listo para aplicar a la placa de vibratome. Es importante ir tan rápido como sea posible sin dañar el cerebro.
2. El tejido cerebral puede entonces ser recogidos de debajo, que separa el tejido del hueso subyacente al mismo tiempo que separa los nervios.
3. El tejido se monta y se pega sobre una placa y se coloca en la vibratome. Debido a la anatomía rostral caudal de la SVZ, nos hemos centrado en hacer cortes sagitales ya que preserva la vía migratoria de los neuroblastos, la vaina glial, y la vasculatura que se alinea en gran parte en esta dirección. Uno puede cualquier moUNT el tejido en la línea media o en la superficie plana creada mediante cortes sagitales laterales de la SVZ. Una etapa opcional es colocar un 3% de agarosa bloque detrás del tejido para servir como un tope para la cuchilla como las rodajas se desprenda. Hemos utilizado preferentemente a base de cianoacrilato pegamento.
4. Enjuague la hoja con etanol para eliminar los aceites y enjuague con agua destilada. Coloque la cuchilla en el soporte de la cuchilla. Montar el soporte de la cuchilla a la vibratome.
5. Ajustar la configuración de vibratome para cortar el tejido con un espesor de 250-350 micras por rebanada. Es importante cortar con vibraciones de alta frecuencia y baja velocidad.
6. Sección progresivamente a través del tejido. La aparición del bulbo olfatorio es un buen indicador de que uno está cerca de la SVZ en cortes sagitales como las rodajas más laterales contendrán ni región. Otras señales a tener en cuenta incluyen el ventrículo y el engrosamiento del cuerpo calloso, debajo del cual se encuentra la SVZ. El SVZ aparecerá por primera vez en más Sagit lateralrodajas de Tal. El RMS se mostrará en rebanadas sagital medial.
7. Retire rebanadas contienen la SVZ con una pipeta Pasteur de plástico con la punta cortada. Transferencia a la cámara de retención con slice. A menudo obtener más cortes que podemos utilizar en un día de trabajo. Sin embargo, las rebanadas pueden variar en la cantidad de células que contienen la SVZ. A veces es necesario mirar a través de varias rebanadas de encontrar uno deseada para la imagen.

4. Preparación del microscopio y colorantes

Las rodajas requieren un tiempo de incubación de una hora en ACSF para recuperarse de la disección y rebanar. Varios pasos se pueden realizar durante este período de recuperación rebanada.

1. Preparación de las pipetas para el tinte de calcio y / o la aplicación del fármaco
   1. Pipetas de vidrio debe tener una punta de 2-3 micras de diámetro y una longitud de la punta (~ 2 mm) y el ángulo (~ 16 ° para el soporte de pipetas) que evita el contacto con la cámara de perfusión y permite espacio para la colocación deel objetivo.
   2. Uno puede preparar típicamente 6-8 pipetas de presión para cada día de experimentos.
2. Calcio preparación de tinte
   1. Al preparar la solución de trabajo (4-5 mM de baño, 250 mu M por aplicación de presión), lo mejor es exponer la cantidad mínima de DMSO a las células. Esto se puede lograr haciendo que las poblaciones altamente concentradas. Por ejemplo, para Fluo-4, un tubo que contiene 50 g se utiliza por día. Uno puede hacer un stock de 10 mM de esta alícuota mediante la adición de 4,6 l de solución de Pluronic F-127 20% en DMSO.
3. Preparación de configuración microscopio (Figura 2).
   1. El uso de una bomba peristáltica para el flujo de solución ha ayudado a minimizar la deriva de imagen. Ejecutar la bomba peristáltica antes de permitir ACSF para funcionar a través de las líneas de perfusión y asegurarse de que está libre de burbujas.
   2. Ajuste el tubo de entrada en la cámara de perfusión y asegurar que no haya fugas.
   3. Coloque la punta de vacío para ensure que la solución está siendo aspirado de la cámara de perfusión. Asegúrese de que esté en un nivel adecuado de modo que el objetivo se sumerge en la distancia de trabajo, pero no tan alta como solución que pueden derramarse sobre la cámara. Un bajo nivel de solución también minimizar las distorsiones de flujo. Una aspiración constante también puede ser verificado por la escucha de estabilidad.

5. Colorante de carga

Este método ha sido descrito en detalle en otro manuscrito ^2. Por favor, vea las figuras en el mismo.

1. Baño de colorante de carga
   1. Hacer una solución de 1-2 ml de trabajo del colorante. Para Fluo-4 AM, una concentración de 4-5 mu M es adecuado para el etiquetado de neuroblastos SVZ.
   2. Los sectores se transfiere primero a una placa de cultivo de 35 mm con un fondo de malla que ya está llena con ACSF. Reemplazar la solución mediante el uso de una pipeta de plástico de 3 ml de transferencia para eliminar suavemente la ACSF, mientras que la adición simultánea de la calcium tinte de solución de trabajo.
   3. Incubar a 37 ° C durante 30-60 min en un 5% de CO ₂ gas ambiente controlado.
   4. Coloque la rebanada de nuevo en la cámara de ACSF lleno de celebración para lavar tinte que no ha entrado en las células. Alternativamente, se puede colocar directamente en la cámara de perfusión microscopio que ejecuta ACSF. Este período de lavado es 30-45 min.
   5. Transferir la porción de la cámara de perfusión.
2. Presión de aplicación de tinte
   1. Transferir la rebanada de la cámara de retención de la cámara de perfusión de la configuración del microscopio.
   2. Llenar una pipeta de vidrio con una solución de trabajo que es de 250 mM y el lugar en el micromanipulador.
   3. Bajar la pipeta a la región de interés. La pipeta puede ser colocado de tal manera que la punta es o bien varios micrómetros por encima de la superficie de loncha o enterrados varios micrómetros por debajo de la superficie de loncha, pero lejos de la región grabada. El ángulo de la pipeta no Affect la eficiencia de carga. Cuando la imagen por debajo de la superficie de loncha, encontramos que la colocación de la punta de la pipeta por debajo del plano de la imagen se etiqueta nuestra área deseada formación de imágenes mejor.
   4. Cuando la presión de aplicar el tinte, establecer el Picospritzer modo que es <3 psi. No hemos estimado el volumen de difusión de tinte, porque esto está sujeto a variabilidad del diámetro de la punta de la pipeta, la presión aplicada, y la densidad del tejido en el que se inyecta el medio de contraste. Aplicamos simplemente hasta que logremos nuestra carga deseada según la evaluación de los ojos. Minimizar el daño a la rebanada durante la aplicación, especialmente cuando la punta se coloca debajo de la superficie de la rebanada. Aplicar durante 1-2 minutos. Aplicaciones repetidas veces sean necesarias en función de etiquetado según la evaluación de los ojos. Por esta duración concentración y aplicación, se encuentra que la aplicación superficial de colorante preferentemente etiqueta neuroblastos mientras que por debajo de la superficie de aplicación preferentemente etiquetas de astrocitos. Sin embargo,> 3 min a aplicación 500 mM también se etiqueta neuroblastosindependientemente de si la punta está por encima o por debajo de la superficie de loncha (JC Platel, observación no publicada). Deje para el lavado y la recuperación rebanada durante 30-45 min.

6. Confocal de imágenes de la actividad del calcio

1. Encontrar la región de interés primero con un objetivo de baja potencia tales como 4x o 10x. Colocar en el centro del campo antes de cambiar a un objetivo de potencia mayor. En este punto, se puede evaluar la salud general de rebanada observando la aparición de células SVZ bajo contraste de interferencia diferencial (DIC). Las células sanas aparecen redonda y regordeta. Además, las células sanas se mostrará débil Fluo-4 de carga como se supone que no hay carga en todo o fluorescencia brillante (una célula que muere).
2. Bajar el objetivo de inmersión en agua en la región de interés, que es ahora cargadas con colorante. Ya sea un objetivo de 40x o 60x ha sido adecuada para nuestras necesidades, aunque 40x proporciona un campo de visión más amplio y permite el acceso pipeta mayor. Cuando la imagen por debajo de lasuperficie, que a menudo van de un mínimo de 15 micras por debajo de la superficie donde están mejor tajada de la arquitectura en 3 dimensiones y salud de las células preservadas.
3. Verifique que la perfusión y de vacío están trabajando adecuadamente.
4. Configure el microscopio para que la resolución de lapso de tiempo y la resolución espacial se establecen en las tasas deseadas. Para la microscopía confocal, estos factores deben equilibrarse como un aumento de la resolución temporal generalmente resulta en una pérdida de resolución espacial debido a la naturaleza de escaneo del sistema. Para la actividad del calcio, que han captado un marco aproximadamente cada segundo con una resolución de 512x512 píxeles. Si varios canales adquiridos por separado son necesarios, esto también afectará a las tasas de adquisición. Establecer la duración de la película (2-10 min).
5. Iniciar correr. Si la realización de estudios farmacológicos, lavar en antagonistas o agonistas no desensibilizantes durante al menos 5-10 minutos, y luego hacer otra película de 5-10 min. Los agonistas que pueden desensibilizar los receptores pueden ser extremadamente aplicado, tal como mediante el uso de un prEssure pipeta controlada por un micromanipulador.

7. Análisis Calcio

El análisis sigue los procedimientos estándar que hemos descrito en las publicaciones permeables ^2-4. F ₀ (línea de base, es decir) y F son las intensidades medias de fluorescencia que se mide a través de todas las regiones de interés (ROIs) y en cada ROI, respectivamente. Un cambio en la fluorescencia se considera que un aumento de Ca ^{2 +} si era> 15% F / F ₀ aumento. Intracelular de Ca ^{2 + Los} cambios se calcularon utilizando Calsignal ^5.

8. Los resultados representativos

Hemos sido capaces de obtener carga selectiva de células SVZ en función de los protocolos de carga de colorante descritos anteriormente y en otros lugares ^2-4,6. Baño de carga o aplicación de presión sobre la superficie rebanada de Fluo-4 AM (05.04 ó 250 micras, respectivamente) las etiquetas en su mayoría neuroblastos. Si bien la aplicación de presión puede cargar neurobdura más rápidamente que la carga baño en una sola rebanada, carga baño permite la carga simultánea de varios sectores. Se confirma la identidad de las células marcadas como neuroblasts por (1) si presentan un comportamiento migratorio ^4,7, (2) su morfología, (3) la tinción negativa de sulforrodamina 101, un colorante específico de astrocitos ³ o (4) con tinción positiva DCX-DsRed expresión (JC Platel, observación no publicada). Los neuroblastos migrar rápidamente (media de 60 micras / hr) a temperatura fisiológica ^4,7-9, pero su movimiento puede ser observada fácilmente incluso a temperatura ambiente. El movimiento de los neuroblastos no plantea un problema con respecto a la colocación de regiones de interés (ROI) para rastrear la actividad del calcio ya que nuestras películas son por lo general de corta duración. Sin embargo, durante largos períodos de espera, como por ejemplo durante los intercambios solución de fármaco, los investigadores deben tener cuidado para que coincida con ROIs en el control y períodos de tratamiento. No es raro que los neuroblastos a migrar dentro o fuera de la i maging campo o plano focal.

Aplicación de presión de Fluo-4 AM (250 micras) de profundidad en el corte y la duración limitada (<2 min) preferentemente etiqueta astrocitos SVZ ^2. Etiquetado astrocito ha sido verificada por etiquetado positivo con sulforrodamina 101 y su morfología, especialmente por la presencia de proyecciones y endfeet sobre los vasos sanguíneos que hemos descrito recientemente ^3. Usando estos métodos, hemos observado la actividad espontánea en tanto la neuroblast SVZ y población de astrocitos (Figura 1). La actividad en los astrocitos a menudo toma la forma de ondas que se dedican a ³ de los vasos sanguíneos. Además, el uso de imágenes de calcio como un ensayo, la aplicación de agonistas farmacológicos ha revelado o confirmado la expresión de los receptores GABA _A en neuroblastos y astrocitos ^6, AMPA y NMDA receptores en neuroblastos ^4.

Figuras

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Figura 1. Propagación de la actividad del calcio en los astrocitos. (A) Representante promedio imagen de una grabación de lapso de tiempo de actividad del calcio. Los astrocitos en la SVZ se cargaron con aplicación de presión de Fluo-4 AM deep en la rebanada. Películas fueron adquiridas en 0,75 s pasos de tiempo. Las regiones de interés (ROI) se colocan sobre las células que muestran actividad. (B) Restos de ROIs coloca sobre las células de la película se muestra en (A). Las huellas se filtraron con un promedio móvil y normalizado. La escala vertical representa 2 x Df / F ₀ donde F es la intensidad de la señal y F ₀ es la señal de línea base media y Df = ₀ FF.

Figura 2. Fotografía del sistema de perfusión. Un extremo de un tubo se sumerge en 95% de O _2/5% CO ₂ gas p-erfused solución. La solución después se perfundió a través del tubo y de la cámara de baño por una bomba peristáltica (no se muestra). El otro extremo se inserta en la entrada de la solución de la cámara de baño montado sobre una plataforma. La punta de aspiración se conecta entonces a la salida de disolución de la cámara y se fija a un nivel para determinar la altura solución. Desde la salida, la punta de aspiración está conectada a la línea de vacío, que aspira la solución de la cámara en un contenedor de residuos. El sistema de perfusión se muestra fuera de la platina del microscopio para mayor claridad visual.

Discusión

Imágenes de calcio de células SVZ se ha utilizado para estudiar los patrones de actividad espontánea en neuroblastos ^10, la expresión del receptor de canal en ambos neuroblastos y astrocitos ^4,6,8 y ondas astrocíticos calcio ^3. Dado que las células en la SVZ son o bien inmaduros o que tienen propiedades gliales, no se activan los potenciales de acción ^11,12, lo que significa que los cambios en el potencial de voltaje de milisegundos indicativos de la actividad en las re...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluto	Empresa	Número de Catálogo	Disección (mM)
Sacarosa	Sigma	S0389	Disección: 147 mM ACSF: 0 mm
NaCl	Sigma	S9888	Disección: 42 mM ACSF: 126 mM
KCl	Sigma	P3911	Disección: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM
MgCl 2 .6 H 2 O	Sigma	M9272	Disección: 4,33 mM ACSF: 1 mM
NaH 2 PO 4. H 2 O	Sigma	S8282	Disección: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM
Glucosa	Sigma	G8270	Dissección: 10 mM ACSF: 10 mM
NaHCO 3	Sigma	S6014	Disección: 26 mM ACSF: 26 mM
De CaCl 2 .2 H 2 O	Sigma	C3306	Disección: 1,33 mM ACSF: 2 mM

			[Encabezado]
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vibratome	Leica	VT 1000S
Super Glue	Surehold o 3M	Surehold 3G Super Glue o 3M Vet-Bond
Herramientas de disección	Roboz o Ted Pella
Fluo-4 a.m. sensible al calcio, colorante	Invitrogen	F14201
Oregon Green BAPTA-1 AM colorante sensible al calcio	Invitrogen	O6807
Pluronic F-127 20% de solución en DMSO	Invitrogen	P3000MP
Microscopio confocal vertical	Olimpo	FV300 o FV1000
Inmersión en agua objetivos	Olimpo	LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90)
Micromanipuladores	Sutter	MPC-200/MPC-325/MPC-385
Presión	Parker Hannifin	Picospritzer	<3 PSI durante la aplicación
Pipetear extractor	Sutter o Narshige	Sutter P-97, o Narshige PP-830
Pipetas de vidrio	Sutter	BF150-110-10	ID: 1.10, OD: 1,50
Bomba peristáltica	Harvard Apparatus	Modelo 720	velocidad de flujo: 1 ml / min
Cámara de baño	Warner Instruments	RC-26 GLP	De bajo perfil permite un aclaramiento objetivo
Tubería	Tygon
Controlador de temperatura	Warner Instruments	TC-324B/344B