Подготовка Острый субвентрикулярной фрагменты зона для кальция изображений

Резюме

Метод для загрузки субвентрикулярной зону (СВЗ) клеток кальцием индикатор красители для записи активности кальция описано. Послеродовой SVZ содержит плотно упакованных клеток, включая нервные клетки предшественники и нейробластов. Вместо того чтобы использовать ванну загрузки мы вводили красителя давление внутри тканей позволяет лучше красителя диффузии.

Аннотация

Субвентрикулярной зону (СВЗ) является одним из двух нейрогенных зон в постнатальном мозге. SVZ содержит плотно упакованных клеток, включая нервные клетки предшественники с астроцитов особенностей (так называемые SVZ астроциты), нейробластов и промежуточных клеток-предшественников. Нейробластов родился в SVZ касательной мигрировать на большие расстояния в обонятельную луковицу, где они дифференцируются в интернейронов. Межклеточной передачи сигналов через молекул адгезии и диффузии сигналы играют важную роль в борьбе с нейрогенеза. Многие из этих сигналов вызывают межклеточное деятельности кальция, который передает информацию внутри и между клетками. Кальций деятельности, таким образом, отражает активность внеклеточных сигналов и является оптимальным способом понять функциональное межклеточной сигнализации между клетками SVZ.

Кальций деятельность изучалась во многих других регионах и типах клеток, в том числе зрелые астроциты и нейроны. Тем не менее, традиционный метод, чтобы лоаг клеток кальцием индикатор красителя (например, ванны нагрузки) не был эффективным при загрузке всех типов SVZ клетки. Действительно, сотовая плотность в SVZ препятствует диффузии красителя в ткань. Кроме того, готовится сагиттальных будет лучше сохранить трехмерное расположение клеток СВЗ, в частности, поток миграции нейробластов на ростральной-каудальной оси.

Здесь мы опишем методы для подготовки сагиттальной разделов, содержащих SVZ, загрузка клетки SVZ с кальцием краситель индикатор, и приобретение кальция деятельность с покадровой фильмов. Мы использовали Fluo-4 утра краситель для загрузки SVZ астроциты с помощью давления приложения внутри ткани. Кальций деятельности был записан при помощи сканирующей конфокальной микроскопии позволяет точное разрешение для различения отдельных клеток. Наш подход применим и к другим нейрогенных зон, включая взрослого гиппокампа субгранулярной зоны и эмбриональных нейрогенных зон. Кроме того, другие виды красителей можетнаноситься с помощью описанного метода.

протокол

1. Подготовка Solutions, Dissection, и Vibratome

1. Решения должны быть готовы в нужный осмолярности и рН (табл. 1). По сравнению с искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF), рассечение раствор готовят с более низкой концентрации натрия и кальция, а более высокие концентрации магния. Это необходимо для минимизации токсичности эффектов во время нарезки.
2. Оба рассечения и ACSF решения должны быть насыщенным с 95% O _2/5% CO ₂ при пропускании по крайней мере 10 минут, чтобы достичь желаемого рН 7,3.
3. Подготовка ледяной бане в лоток. Место рассечения пластины в ледяной бане и заполнить с рассечением решение. Bubble вскрытии пластины.
4. Подготовка vibratome путем создания ледяной бане. Поместите секционирования блюдо в ледяной бане, заполните блюдо с рассечением решение, и пузырь.
5. Заполните кусочек проведения камера с ACSF и пузырь, чтобы решение адекватно газированные независимо, где ломтики находятся.

2. Удаление ткани головного мозга

Острые кусочки мозга, как правило, здоровее с молодыми мышами. Сотовая архитектура послеродовой SVZ в зрелом грызунов вокруг день после рождения (P) 20 ^1. Таким образом, мы стараемся ограничить наши эксперименты на мышь возрасте от P20-P30, но мы провели успешные эксперименты на мышах же стара, как 3 месяца. На протяжении обработки тканей, надо иметь в виду свести к минимуму механические движения и давления на мозг, поддерживают охлаждением условиях, и подвергать SVZ к решению как можно быстрее следующей жертвой.

1. После введения пентобарбитала, мыши быстро обезглавлен. Мех снимается и разрезы делаются через основание черепа. Глава затем помещается в лоток с рассечения решение.
2. В то время как стабилизация голову щипцами, непрерывное сокращение производится вокруг черепа, а иногда и до средней линии с microscissors. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму контакт с тканью. Так как обонятельные луковицы является конечным пунктом новорожденных нейронов из SVZ, надо помнить о сохранении этого региона, особенно во время удаления кости вокруг этой области. Microscissor сокращений составил около череп должен быть на спинной стороне, для легкого удаления части черепа.
3. Удаление черепа покрывающей мозг теперь отделено от костей под мозга. Если сокращения в предыдущем шаге сделаны правильно, это вышележащих кости могут быть легко удалены с помощью пинцета или щипцов.
4. В то время как все еще держа голову щипцами, можно использовать хирургические лезвия для корректного удаления нескольких кусков ткани головного мозга до нарезки, например, следующие. Корональных разрез может быть сделан на уровне лямбда. Сагиттальный сокращения могут быть сделаны с обеих сторон мозга сбоку от SVZ. По самым скромным подсчетам составит ~ 2,5 мм от средней линии. При желании, мозг также может быть hemisected здесь. Эти сокращения и FACILitate монтажа ткани и позволяют SVZ должно быть достигнуто быстрее, когда мозг нарезки. Важно помнить, чтобы оказывать минимальное количество механических сил на мозге (например, не толкать или тянуть).

3. Острый Подготовка фрагмента мозга

1. Для подготовки последующих шагов, убедитесь, что супер клей используется для монтажа ткани бесплатно сабо и готовы обратиться к vibratome пластины. Важно, чтобы идти как можно быстрее, не повреждая мозга.
2. Мозговая ткань может быть зачерпнул снизу, которая отделяет ткани от основной кости одновременно отделения нервы.
3. Ткань монтируется и наклеенные на пластину и помещают на vibratome. В связи с ростральной-каудальном анатомии SVZ, мы сосредоточились на том, сагиттальных, как она сохраняет миграционный путь нейробластов, глиальные оболочки, и сосудистую, которые в основном ориентированы в этом направлении. Можно либо движениеЕНТ ткани по срединной линии или на плоской поверхности, созданные путем сокращения сагиттальной сбоку от SVZ. Необязательный шаг заключается в размещении в 3% агарозном блока за тканью в качестве упора на лезвие, как кусочки оторваться. Мы использовали преимущественно цианакрилатного на основе супер клей.
4. Промойте лезвие с этанолом для удаления масел и промыть дистиллированной водой. Поместите лезвие ножа. Установите держатель лезвия к vibratome.
5. Настройте параметры vibratome, чтобы сократить ткани при толщине 250-350 мкм на срез. Важно, чтобы сократить использование высокочастотных вибраций и низкая скорость.
6. Раздел постепенно через ткань. Появление обонятельной луковице является хорошим показателем, что одна рядом с SVZ в сагиттальных как наиболее боковой ломтиками будет содержать ни регионе. Другие ориентиры для поиска включают желудочка и утолщение мозолистого тела, под которым SVZ находится. SVZ появится первый в более боковых СагитТаль ломтиками. RMS покажет в медиальной сагиттальной ломтиками.
7. Удалите ломтики содержащие SVZ с пластиковой пипетки Пастера с наконечником отрезать. Передача в камеру холдинга срез. Мы часто получения более ломтиками, чем мы можем использовать в течение рабочего дня. Тем не менее, ломтики будет варьироваться от количества клеток, содержащих SVZ. Иногда бывает необходимо просмотреть несколько ломтиков, чтобы найти тот желанный для работы с изображениями.

4. Подготовка микроскопа и красителей

Ломтиками требуют одного часа времени инкубации в ACSF, чтобы оправиться от вскрытия и нарезки. Несколько шагов может быть выполнено в течение этого периода восстановления срез.

1. Подготовка пипетки для красителя кальция и / или применение препарата
   1. Стеклянные пипетки нужно, чтобы у кончика 2-3 мкм в диаметре и длиной наконечника (~ 2 мм) и угол (~ 16 ° С в течение держатель пипетки), который предотвращает контакт с перфузионной камере и оставляет место для размещенияцель.
   2. Можно подготовить обычно 6-8 пипетки давления на каждый день эксперимента.
2. Подготовка кальция красителя
   1. При подготовке рабочего раствора (4-5 мкм ванны, 250 мкм под давлением приложение), то лучше, чтобы выставить минимальный размер ДМСО к клеткам. Это может быть достигнуто путем высокой концентрации запасов. Например, для Fluo-4, одну пробирку, содержащую 50 мкг используется в сутки. Можно сделать 10 фондовом мМ этого аликвоты путем добавления 4,6 мкл Pluronic F-127 20% раствора в ДМСО.
3. Подготовка микроскопа установки (рис. 2).
   1. Использование перистальтический насос для подачи раствора помогла свести к минимуму изображения дрейф. Запустите перистальтического насоса до ACSF позволяют запустить через перфузии линии и убедиться, что он без пузырьков.
   2. Установить входе в трубу на перфузии камеры и убедиться в отсутствии утечек.
   3. Установите вакуумный наконечник ENSЮр, что решение в настоящее время отсасывают из перфузии камеры. Убедитесь, что она находится на адекватном уровне, так что задача погружается в надлежащее рабочее расстояние, но не настолько высокие, что решение может перекинуться на камеру. Низкий уровень решения также минимизирует искажения потока. Постоянное стремление также может быть проверено путем прослушивания устойчивость.

5. Краска Загрузка

Этот метод был подробно описан в другой рукописи ^2. Пожалуйста, ознакомьтесь с цифрами в нем.

1. Красителя Ванна загрузки
   1. Сделайте 1-2 мл рабочего раствора красителя. Для Fluo-4 AM, концентрация 4-5 мкм достаточно для маркировки SVZ нейробластов.
   2. Ломтики сначала перевели в 35 мм культуры блюдо с сеткой нижней, которая уже заполнена ACSF. Заменить решение с помощью 3 мл пипетки пластиковые передачи аккуратно удалить ACSF, одновременно добавив вalcium рабочий раствор красителя.
   3. Инкубировать при 37 ° С в течение 30-60 мин в 5% CO ₂ газ-контролируемой среде.
   4. Поместите кусочек обратно в ACSF заполненные проведение камеру, чтобы смыть краску, которая не вступила клеток. Кроме того, можно поместить его прямо на камере микроскопа перфузии, на котором работает ACSF. Это мыть период 30-45 мин.
   5. Передача срез к перфузионной камере.
2. Давление применением красителя
   1. Передача ломтик от проведения камере перфузии камеры на микроскоп установки.
   2. Заполните стеклянную пипетку с рабочего раствора, что составляет 250 мкм и место на микроманипулятора.
   3. Опустите пипетку в область интересов. Пипетки может быть размещена таким образом, чтобы кончик либо нескольких микрометров выше срез поверхности или похоронены несколько микрометров ниже среза поверхности, но от записанного региона. Угол пипетки не AFFEКТ загрузки эффективность. Когда изображение ниже среза поверхности, мы находим, что размещение пипетки ниже изображения самолет будет маркировать нашу желаемую область изображения лучше.
   4. Когда давление применением красителя, установить Picospritzer так, чтобы она <3 атм. Мы еще не оценили объем красителя диффузии, так как это является предметом изменчивости диаметра кончика пипетки, давление и плотность ткани, где краситель. Мы применяем просто пока не добьемся желаемых нагрузку, как оценивать на глаз. Минимизации ущерба для среза во время нанесения, особенно когда головка помещена под срез поверхности. Подать заявку на 1-2 мин. Иногда повторного применения необходимы в зависимости от маркировки, как оценивать на глаз. Для этого продолжительность концентрации и приложений, мы обнаружили, что поверхность применением красителя преимущественно называет нейробластов в то время как под поверхностью применение преимущественно называет астроцитов. Тем не менее,> 3 мин приложений при 500 мкМ также маркировать нейробластовнезависимо от того, кончик выше или ниже поверхности среза (JC Платель, неопубликованные наблюдения). Разрешить для стирки и кусочек восстановления в течение 30-45 мин.

6. Конфокальной микроскопии кальция активность

1. Найти интересующую область сначала с низким энергопотреблением, таких как объективный 4x или 10x. Поместите в центре поля, перед переходом на более высокую мощность цель. На данный момент, можно оценить общее состояние здоровья срез, отметив появление клеток SVZ под дифференциального интерференционного контраста (DIC). Здоровые клетки появляются круглые и пухлые. Кроме того, здоровые клетки покажет слабый Fluo-4 нагрузку, как предполагалось нет нагрузки на всех или ярко флуоресценции (умирающих клеток).
2. Опустите воды погружения цель на область интересов, которая в настоящее время красителя загружены. Либо 40x или 60x целью было достаточно для наших потребностей, хотя 40x обеспечивает более широкое поле зрения и обеспечивает большую пипетку доступа. Когда изображение нижеповерхности, мы часто ходим по меньшей мере 15 мкм ниже среза поверхности, где 3-мерного архитектуры и клеточной здоровья лучше сохраняются.
3. Убедитесь, что перфузия и вакуума работает надлежащим образом.
4. Настройте микроскоп, так что покадровой разрешение и пространственное разрешение устанавливается в нужное ставки. Для конфокальной микроскопии, эти факторы должны быть сбалансированы как увеличение временное разрешение обычно приводит к потере пространственного разрешения за счет сканирования характер системы. Для кальция деятельности, мы отображаемого кадра примерно каждый второй с 512x512 пикселей. Если несколько каналов, приобретенные отдельно необходимо, это также влияет на приобретение ставки. Установить продолжительность фильма (2-10 мин).
5. Начать работать. При выполнении фармакологических исследований, мыть на антагонисты или не десенсибилизирующее агонисты, по крайней мере 5-10 минут, а затем сделать еще один фильм из 5-10 мин. Агонисты, которые могут уменьшить чувствительность рецепторов может быть острой применяется, например, с помощью пр.Essure пипетки контролируется микроманипулятора.

7. Кальций анализ

Анализ следующие стандартные процедуры, которые мы описали в предыдущее публикациях ^2-4. F ₀ (т. е. базовая линия) и F являются средние интенсивности флуоресценции измеряли во всех регионах, представляющих интерес (трансформирования) и в каждом ROI, соответственно. Изменение флуоресценции считается Ca ^{2 +} увеличение, если оно было> 15% F / F ₀ увеличением. Внутриклеточного Ca ^{2 +} изменения были рассчитаны с использованием Calsignal ^5.

8. Представитель Результаты

Мы смогли получить выборочной загрузки клеток SVZ в зависимости от красителя протоколы загрузки описано выше, и в других местах ^2-4,6. Загрузка Ванна или приложения давления на срезе поверхности Fluo-4 AM (4-5 или 250 мкм, соответственно) метки основном нейробластов. В то время как давление приложение может загрузить neurobдлится более быстро, чем ванна нагрузка в одном срез, ванна загрузки позволяет одновременной загрузки нескольких ломтиков. Мы подтверждения личности меченых клеток, как нейробластов из (1) ли они отображают миграционного поведения ^4,7, (2) их морфологии, (3) отрицательная окраска сульфородамина 101, астроцитов конкретного красителя ³ или (4) положительное окрашивание DCX-DsRed выражении (JC Платель, неопубликованные наблюдения). Нейробластов мигрировать быстрее (в среднем 60 мкм / ч) при физиологической температуре ^4,7-9, но их движение может быть легко наблюдать даже при комнатной температуре. Движение нейробластов не представляет проблемы в отношении размещения регионах интересов, (ROI) для отслеживания кальция деятельность с нашими фильмами, как правило, короткие по продолжительности. Тем не менее, в течение долгого периода ожидания, например, при обмене лекарственный раствор, следователи должны быть осторожны, чтобы соответствовать трансформирования в контроле и лечении периоды. Это не редкость для нейробластов мигрировать внутрь или наружу я поля maging или фокальной плоскости.

Давление применение Fluo-4 AM (250 мкм) глубоко в часть и в течение ограниченного срока (<2 мин) преимущественно называет SVZ астроциты ^2. Astrocyte маркировки была подтверждена положительными маркировки с сульфородамина 101 и их морфология, особенно в присутствии прогнозы и endfeet на кровеносные сосуды, которые мы недавно описал ^3. Используя эти методы, мы наблюдали спонтанную активность в обоих нейробластов SVZ и астроцитов населения (рис. 1). Деятельность в астроциты часто принимает форму волны, которые занимаются ³ кровеносных сосудов. Кроме того, использование кальция визуализации, как анализ, применение фармакологических агонистов выявила или подтвердила выражение GABA рецепторы на нейробластов и астроциты ^6, AMPA и NMDA-рецепторов на нейробластов ^4.

Данные

1 "SRC =" / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Распространение кальция деятельность в астроциты. (A) представитель среднем изображение с покадровой записью кальция деятельности. Астроциты в SVZ были загружены с давлением применение Fluo-4 утра в глубину среза. Фильмы были приобретены на 0,75 с временем действия. Регионы интереса (ROI) расположены над клетки, обладающие активностью. (B) Следы от РИ находится над клетками из фильма изображены на (A). Следы были отфильтрованы с помощью скользящей средней и нормирован. Вертикальная шкала представляет собой 2 х f / F _0, где F является интенсивность сигнала и F ₀ является средним сигнала базовой и f = FF _0.

Рисунок 2. Изображение перфузии системы. Один конец трубки погружают в 95% O _2/5% CO ₂ газ-рerfused решение. Затем раствор перфузии через трубку и в баню камеры перистальтического насоса (не показан). Другой конец вставляется в решении входе в ванну камеры установлены на платформе. Стремление наконечника подключаются к решению выходе из камеры и установлены на уровне, чтобы определить решение высоту. Из розетки, стремление чаевые подключен к вакуумной линии, которая всасывает раствор из камеры в контейнер для отходов. Перфузионной системы показана у столик микроскопа для наглядности.

Обсуждение

Кальций визуализации клеток SVZ была использована для изучения закономерностей в спонтанной активности в нейробластах ^10, рецептор канала выражения в обоих нейробластов и астроциты ^4,6,8 и астроцитов волны кальция ^3. Так как клетки в SVZ либо незрелый или иметь глиальных с?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Растворенное вещество	Компания	Номер в каталоге	Dissection (мМ)
Сахароза	Сигма	S0389	Dissection: 147 мм ACSF: 0 мм
NaCl	Сигма	S9888	Dissection: 42 мм ACSF: 126 мм
KCl	Сигма	P3911	Dissection: 2,5 мм ACSF: 2,5 мм
MgCl 2 .6 H 2 O	Сигма	M9272	Dissection: 4,33 мМ ACSF: 1 мМ
NaH 2 PO 4. H 2 O	Сигма	S8282	Dissection: 1,25 мм ACSF: 1,25 мм
Глюкоза	Сигма	G8270	Диссеие: 10 мМ ACSF: 10 мМ
NaHCO 3	Сигма	S6014	Dissection: 26 мм ACSF: 26 мм
CaCl 2 · 2H 2 O	Сигма	C3306	Dissection: 1,33 мм ACSF: 2 мм

			[Заголовок]
Имя	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Vibratome	Leica	VT 1000S
Super Glue	Surehold или 3M	Surehold 3G супер клей или 3M Vet-Бонд
Dissection инструменты	Roboz или Ted Pella
Fluo-4 утра кальций-чувствительных красителей	Invitrogen	F14201
Орегон Зеленый ВАРТА-1 утра кальций-чувствительных красителей	Invitrogen	O6807
Pluronic F-127 20% раствора в ДМСО	Invitrogen	P3000MP
Вертикальный конфокальной микроскопии	Олимп	FV300 или FV1000
Вода погружения цели	Олимп	LUMPlanFl 40 х W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 х W / I (NA 0,90)
Микроманипуляторы	Sutter	MPC-200/MPC-325/MPC-385
<Регулятор давления/ TD>	Parker Hannifin	Picospritzer	<3 PSI во время нанесения
Внесите съемника	Саттер или Narshige	Саттер Р-97 или Narshige PP-830
Стеклянные пипетки	Sutter	BF150-110-10	ID: 1,10, диаметр: 1,50
Перистальтический	Harvard Apparatus	Модель 720	Скорость потока: 1 мл / мин
Палата ванной	Warner Instruments	RC-26 GLP	Низкий профиль позволяет объективно оформление
Трубы	Tygon
Регулятор температуры	Warner Instruments	TC-324B/344B