Los pequeños extractos nucleares para ensayos funcionales de los mecanismos de expresión de genes

Resumen

Un protocolo para la preparación de los sólidos, los pequeños extractos nucleares HeLa se describe. Este protocolo es muy valioso para los ensayos que requieren el uso de pequeñas poblaciones de células, como las células tratadas con drogas o RNAi. El método debe ser aplicable a una amplia variedad de ensayos de expresión de genes y otros tipos de células, incluyendo células del paciente.

Resumen

Una gran cantidad de avances en la expresión de la comprensión genética se ha realizado utilizando sistemas in vitro. Para la mayoría de los estudios, ensayos funcionales se llevó a cabo utilizando extractos que se preparan en grandes cantidades a 10-50 o más litros de células cultivadas en suspensión. Sin embargo, estas preparaciones a gran escala no son susceptibles de prueba rápida de los efectos in vitro que resultan de una variedad de tratamientos celulares in vivo o condiciones. Este artículo de vídeo revista muestra un método para preparar funcionales pequeños extractos nucleares, utilizando células HeLa como un ejemplo. Este método se lleva a cabo utilizando tan sólo tres placas de 150 mm de las células cultivadas como monocapas adherentes. Para ilustrar la eficacia de los extractos de pequeña escala, que demostrar que son tan activos como los extractos nucleares a granel para acoplados a la RNA polimerasa II transcripción / empalme de las reacciones. Para demostrar la utilidad del protocolo extracto, se muestra que el empalme se suprime en los extractos preparados a partir de células HeLas tratados con el fármaco inhibidor de empalme E7107. El protocolo de pequeña escala deben ser aplicables a cualquier proceso o tipo de célula que puede ser investigado in vitro utilizando extractos celulares. Estas incluyen las células del paciente que sólo están disponibles en cantidades limitadas o las células expuestas a numerosos agentes como las drogas, los agentes que dañan el ADN, los ARNi, o de transfección, que requieren el uso de las poblaciones de células pequeñas. Además, pequeñas cantidades de células recién cultivadas son convenientes y / o necesario para algunas aplicaciones.

Protocolo

1. Crecimiento de las células HeLa para la extracción nuclear

1. Placas células HeLa en tres placas de 150 mm con medio DMEM suplementado con FBS al 10% y 1% de penicilina / estreptomicina. Crecer en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO ₂ hasta que las células son el 90% confluente.

Dividir Consejo-las células de una placa de 1:10 confluentes y la cosecha 3 días después de dividir.

Tip-Una placa adicional que se puede cultivar en caso de que no son suficientes células con tres placas (por ejemplo, si las células son menos del 90% confluentes).

2. Preparar y Chill Soluciones extracto nuclear

1. Prepare nuevas soluciones como se indica en la Tabla 2.
2. Alícuota de 10 ml de tampón hipotónico en un tubo Falcon de 15 ml. Alícuotas de 1 ml de tampón salino alto y 1 ml de tampón de sal baja en 1,5 ml tubos Eppendorf. Enfríe los topes en el hielo. Agregar los volúmenes apropiados de PMSF y TDT a cada tampón inmediatamente antes de su uso (ver Tabla 1).

3. Recolección de las células HeLa para la extracción nuclear

1. Aspirar medios de las células y se lavan las células una vez con 13 ml de PBS 1X a temperatura ambiente por placa.
2. Aspirar el lavado con PBS.

Tip-Aspirar la mayor cantidad de PBS como sea posible por primera aspiración, a continuación, la placa de pie sobre su lado, esperando unos segundos, y aspirar el resto.

3. El uso de un levantador de células, raspar las células hasta el borde inferior de las placas, y luego transferir las células a un tubo Eppendorf. Evite hacer burbujas. Las 3 placas de células tomadas por raspado debe caber en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.

Tip-Es más fácil calcular el volumen de las células, si un tubo Eppendorf se utiliza. Para la escala, utilizar tubos Falcon.

4. Centrifugar a 4 ° C en una microcentrífuga durante 5 minutos a 100 xg para sedimentar las células.

4. Oleaje células HeLa en tampón hipotónico

1. Aspirar cuidadosamente la PBS del sedimento celular y estimar el volumen de células empaquetadas (PCV) mirando a la gradación en el tubo. Tres placas confluentes de células HeLa producir aproximadamente 500 l de PCV.
2. Añadir 2 veces el PCV de tampón hipotónico al sedimento celular. Agitar suavemente para resuspender las células. Use un Pipetman P1000 para volver a suspender con suavidad las células pipeteando arriba y hacia abajo si es necesario.
3. Centrifugar a 4 ° C en una microcentrífuga durante 5 minutos a 100 xg para sedimentar las células. * Las células se han comenzado a hincharse por este tiempo, y el volumen de la celda debe ser ahora alrededor de 750 l-1000 l.
4. Aspirar cuidadosamente el tampón hipotónico y añadir tampón hipotónico nuevo a un volumen final de 1,5 ml. Resuspender las células.
5. Se incuban las células resuspendidas hinchadas en hielo durante 10 min.

5. Lisis de las células utilizando un homogeneizador Dounce

1. Utilice tampón hipotónico para enjuagar el Dounce y luego enfriar en hielo. Limpie la mano del mortero seco con una delicada tarea wiper (por ejemplo, Kimwipe). Retire el resto del búfer de la Dounce con una punta de 1.000 l micropipeta extendida.
2. Transferencia de células inflamadas en el Dounce. Mueva lentamente la mano del mortero apretado de la Dounce arriba y hacia abajo 5 veces para lisar las células, teniendo cuidado de evitar las burbujas.
3. Ensayo para la lisis de las células usando una alícuota de 5 l de células de la Dounce. Colocar la parte alícuota en un tubo Eppendorf y añadir un volumen igual de azul tripán. Ponga la mezcla en un portaobjetos y examinar las células utilizando un microscopio de luz. Los núcleos de las células lisadas se aparecen de color azul. Aproximadamente el 90% de lisis es ideal.

Tip-El número de veces que las células deben ser dounced variará dependiendo de la estanqueidad de la Dounce. Al llevar a cabo este protocolo, por primera vez, determinar el número de veces para Dounce mediante la realización de paso 5,3 después de cada golpe con el Dounce. No sobre-Dounce, douncing excesiva destruye los núcleos.

4. Transferir las células lisadas a un pre-Chilled tubo Eppendorf y el giro en una microcentrífuga 4 ° C por 5 min a 1500 x g. El sedimento contiene los núcleos. Transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo sin interrumpir los núcleos. El sobrenadante contiene el citoplasma.

Tip-El citoplasma puede utilizarse tal cual o procesado para un S100 mediante la misma alta velocidad de centrifugado utilizada para los extractos a granel (véase ¹ para la preparación de un activo a partir de extractos S100 a granel).

6. Sal-Extraer los Núcleos

1. Estimar el volumen del concentrado Nuclear (PNV) mirando a la graduación en el tubo. Un PCV de 500 l por lo general se obtiene un PNV de 400 l.
2. Añadir ½ X PNV de tampón Sal baja a los núcleos mediante la inserción de una punta de la micropipeta a la parte inferior del tubo y lentamente chorros del buffer en los núcleos mientras que suavemente la mezcla. No utilice la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Agitar suavemente los tubos para asegurarse de que el sedimento se resuspendió completamente en el tampón de sal de baja antes de continuar.
3. Agregar ½ X PNV de tampón de sal y mezclar rápidamente una vez invirtiendo el tubo. No agite. Girar a 4 ° C durante 30 min.

Consejo-Sé amable con los núcleos cuando están en tampón salino alto para evitar la lisis de ellos.

4. Derivado a 4 ° C en una microcentrífuga durante 15 min a 18.000 x g. El sobrenadante es el extracto de altas concentraciones de sal nuclear (HS-NE). Tres placas de células generalmente obtienen 500-600 l de HS-NE.

7. Concentrado y Dializar el extracto nuclear

1. Transferencia de 500 l de la SA-NE en frío mini centricons (Amicon) y vuelta por 50 min a 4 ° C en una microcentrífuga a 14000 x g. Invertir el mini-Centricon (Amicon) y colocarlo en un nuevo tubo Eppendorf. Girar durante 2 min a 4 ° C 1000 xg para recuperar el SA-NE. El HS-NE se concentró hasta aproximadamente 115 l.
2. El uso de un Pipetman P200, transferir 45 ml de alícuotas de la SA-NE en mini-diálisis Slide-A Lyzers, y colocarlos en el 500 ml de tampón de diálisis refrigerados. Asegurarse de que la parte inferior de la diapositiva-A-Lyzer está alineado con la parte inferior del flotador. Se agita durante 1-2 horas a 4 ° C. El NE aparecerán nubes después de la diálisis.

Tip-No centrifugar para eliminar el precipitado turbio que se observa después de la diálisis, ya que esto reduce la actividad de la centrifugación del extracto.

3. El NE puede ser utilizado inmediatamente o alícuotas. Alícuotas debe destello congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. El NE se puede almacenar y se someten al menos dos ciclos de congelación-descongelación sin perder actividad.

8. Los resultados representativos

Recientemente, eficiente en sistemas in vitro para acoplar la transcripción RNAP II de empalme se desarrollaron ^2-5. Estos sistemas emplean células HeLa que crecen a granel y por lo tanto no son susceptibles a la rápida probar los efectos de los tratamientos específicos celulares en múltiples muestras. Basado en este necesita unª de la utilidad general de un protocolo de extracto de pequeña escala (ver Discusión), hemos establecido una sólida pequeña escala método de extracto nuclear. Los datos representativos que comparan la RNAP II transcripción / empalme de reacción en el extracto nuclear de pequeña escala con el extracto nuclear a granel se muestra en la Figura 2. Un constructo de CMV-ADN, que contiene el promotor de CMV y codifica un sustrato de empalme estándar (Ftz ^3, la Figura 2A) se utilizó para el análisis. Cuando esta construcción se incubó en la mayor parte (carriles 1-3) o en pequeña escala (carriles 4-6) extracto, niveles similares de la naciente pre-ARNm se sintetizaron por el punto de tiempo de 5 minutos (Figura 2, carriles 1 y 4 ). Después de la adición de α-amanitina para bloquear la transcripción adicional, los compuestos intermedios de empalme y productos empalmados acumulada en el tiempo con la cinética similares en ambos tipos de extractos (Figura 2, calles 2, 3, 5, 6). Estos resultados representativos muestran que la eficacia del golpe dirigida por RNAP II transcripción / empalme sistema es similar en los extractos nucleares a granel y en pequeña escala.

Para demostrar la utilidad del método de extracto de pequeña escala, se prepararon extractos de células HeLa tratadas con el inhibidor de empalme, E7107, o el control de pladienolide compuesto negativo F ^6,7 y luego el acoplado RNAP II transcripción / empalme ensayo se llevó a cabo. Como se muestra en la Figura 3, la transcripción por RNAP II producido eficientemente en extractos preparados a partir tanto de la F Pladienolide y E7107 células tratadas (10 puntos de tiempo min). En contraste, el empalme se produjo normalmente en el extracto preparado a partir de los tratados con Pladienolide F-células, pero fue suprimido en las células tratadas con E7107 (Figura 3, 20-60 puntos de tiempo min). Estos datos proporcionan una prueba de concepto para el uso de los extractos nucleares de pequeña escala para el tratamiento especial de las células en pequeña escala.

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Figura 1. Esquema del Protocolo de extracto de pequeña escala. Paso P1. Las células se cultivan como monocapas, cosechados a partir de placas utilizando un levantador de células y se hincha por la adición de tampón hipotónico. Paso P2. Las células se lisaron usando un homogeneizador Dounce y se centrifugó para sedimentar los núcleos. Paso P3. Los núcleos se separan del citoplasma y se someten a la extracción de sal. Paso P4. El extracto nuclear se concentra y se dializa. Paso P5. Los resultados se obtienen que muestran que los extractos nucleares son funcionales (véase la Figura 2 para mayor detalle).

Figura 2. Los pequeños extractos nucleares son robustos en un acoplado RNAP II transcripción / empalme de ensayo. A. Esquema de la plantilla de la DNA del CMV Ftz utilizado para acoplado RNAP II transcripción / empalme. El promotor de CMV y los tamaños de los exones y el intrón se indican. B. Comparación de acoplamiento RNAPII transcripción / empalme de ensayo utilizando el extracto a granel nuclear o de pequeña escala extracto nuclear. α-amanitina se añadió después de 5 minutos de la transcripción y de empalme se permitió que se produzca durante 30 min y 60. Se extrajo el ARN y se fraccionó en un gel de poliacrilamida al 5% de desnaturalización y detectado por phosphoimager. Los compuestos intermedios de empalme y productos se indican. El endógeno snRNA U6 y ARNt presentes en el extracto y que son ³² marcada con P durante la incubación se indican. Ver ³ para un protocolo detallado sobre el acoplado de transcripción RNAP II / empalme del sistema.

Figura 3. Los pequeños extractos nucleares preparados a partir de células HeLa tratadas con el fármaco inhibidor de empalme E7107 son defectuosas en el empalme. Las células fueron tratadas con 3 Pladienolide mM F o E7107 comodescrito ⁶ y luego se usa para preparar los pequeños extractos nucleares. Un curso de tiempo se llevó a cabo utilizando la misma transcripción / empalme ensayo como en la Figura 2. Los compuestos intermedios de empalme y productos, y U6 snRNA y ARNt se indican.

Discusión

Hemos establecido un método rápido y reproducible para la preparación de extractos nucleares de pequeñas cantidades de células HeLa que crecen como monocapas. Hemos demostrado que estos extractos son robustos al mostrar que la cinética y la eficiencia de RNAP II transcripción / empalme ensayos son similares en los extractos nucleares de pequeña escala y volumen. Hemos demostrado la utilidad de los extractos mediante la demostración de que los extractos preparados a partir de células tratadas con un fármaco inhibidor de empalme son activos para la transcripción pero defectuoso en el empalme.

Nuestro método para preparar los pequeños extractos nucleares se estableció mediante la combinación y la optimización de los métodos previamente establecidos para la fabricación de extractos de células HeLa que crecen en suspensión en gran escala ^1,8 y un método para la pequeña preparación de extractos ^9. Se estableció el protocolo porque los anteriores pequeños extractos no eran funcionales para algunos ensayos, tales como la transcripción acoplado / splicing ensayo. Una diferencia importante entre el anterior protocolo de pequeña escala ⁹ y la nuestra es que hemos optimizado las condiciones para la lisis de las células utilizando un Dounce mini-mientras que el protocolo anterior se lisaron las células empujándolas a través de una pequeña aguja de calibre ^9. Los resultados de lisis de agujas en las burbujas, lo cual puede explicar por qué los extractos estaban inactivos y / o difíciles de reproducir en algunos ensayos. También hemos añadido una etapa de concentración en nuestro protocolo. Este paso aumenta la actividad de los extractos, los cuales son extremadamente sensibles a la concentración, y también limita la variabilidad entre los extractos que es inherente a pequeña escala preparaciones. Finalmente, nuestra preparación se lleva a cabo habitualmente con sólo tres placas de 150 mm de monocapa de células, sin ningún efecto significativo sobre la actividad frente a los extractos de a granel. Por lo tanto, el procedimiento es que se presta fácilmente a los pequeños preparados que requieren reactivos costosos o la disponibilidad limitada de células. Por ejemplo, hemos preparado SMAll escala extractos de células RNAi desmontables y de una leucemia linfática crónica (LLC paciente), y utilizar estos extractos para los ensayos funcionales y / o bioquímicos (EGF, JLH, TY y RR, inédito). Hemos encontrado que los extractos son valiosos para RNAi seguido por ensayos bioquímicos específicos, tales como immunopreciptations, western y tinción de plata. Después de establecer la eficacia de abatir una proteína particular, un estudio más detallado puede llevarse a cabo haciendo una caída estable línea celular, que puede ser utilizada para preparar extractos adicionales a menor costo. La espectrometría de masas de las proteínas presentes en inmunoprecipitados obtenidos a partir de estas líneas celulares desmontables también será una aplicación útil del método. Además de la transcripción acoplado / empalme ensayo que se utilizó como un ejemplo para nuestra descripción protocolo aquí, los extractos de pequeña escala debe ser aplicable en general a numerosos ensayos funcionales y bioquímicas, tales como los utilizados para el pt diferenteeps en la expresión génica (por ejemplo, nivelación, el empalme, la transcripción, poliadenilación, procesamiento de microARN). El protocolo también puede adaptarse para tipos de células del paciente que pueden ser obtenidos ya sea en suspensión (tal como las células CLL) o en cultivos (tales como los fibroblastos del paciente). Finalmente, la fracción citoplásmica obtenida durante el procedimiento debería ser útil para ensayos funcionales y bioquímicas que requieren el citoplasma.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Nombre completo del reactivo	Empresa	Número de catálogo
HEPES	4 - (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico	Sigma	H3375-500G
MgCl 2 .6 H 2 O	Hexahidrato de cloruro de magnesio	Sigma	M2670-500G
KCl	Cloruro de Potasio	Pescador	P335-212
PMSF	Fluoruro de fenilmetanosulfonilo	Sigma	P7626-100G
TDT	Ditiotreitol	América Bioanalítica	AB00490-5G
EDTA	Ácido etilendiaminotetraacético, disódica, dihidrato	América Bioanalítica	AB00500-01000
Glicerol		MP Biomedicals	800689
DMEM	Medio Esencial Mínimo de Dulbecco	Invitrogen	11995-073
FBS	Suero Bovino Fetal	Gibco	16140
La penicilina / estreptomicina		Gibco	15070
PBS	Tampón fosfato salino	Cellgro	21 a 040 CV
Trypan mancha azul del 0,4%		Gibco	15250
Elevadores de celulares		Corning	29442-200
Las placas de 150 mm		VWR	353025
Extendido punta de la micropipeta		Denville	P1126
Homogeneizador Dounce, 1 ml, con su correspondiente mano apretada		Wheaton	357538
Slidealyzers, MWCO 10 kDa		ThermoScientific	69572
Mini-Centricons, MWCO 3kDa		Millipore (Amicon)	UFC500396

Solución	Final	Valores	Dispensar
Hipotónica	HEPES 10 mM, pH 7,9	HEPES 1M, pH 7,9	5 ml
	1,5 mM MgCl 2	1 M MgCl 2	750 l
	10 mM de KCl	3M KCl	1,67 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM de PMSF	500 l
	0,5 mM de DTT	2M TDT	125 l
			Llevar hasta 500 ml con agua
Bajo en Sal	HEPES 20 mM, pH 7,9	HEPES 1M, pH 7,9	2 ml
	1,5 mM de MgCl 2	1 M MgCl 2	150 l
	20 mM de KCl	3M KCl	667 l
& Nbsp;	0,2 mM de EDTA	0,5 M EDTA	40 l
	25% de glicerol	Glicerol	25 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM de PMSF	100 l
	0,5 mM de DTT	2M TDT	25 l
			Trae hasta 100 ml con agua
Salinidad	HEPES 20 mM, pH 7,9	HEPES 1M, pH 7,9	2 ml
	1,5 mM de MgCl 2	1 M MgCl 2	150 l
	1,4 M KCl	3M KCl	48 ml
	0,2 mM de EDTA	0,5 M EDTA	40 l
	25% de glicerol	Glicerol	25 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM de PMSF	100 l
	0,5 mM de DTT	2M TDT	25 l
			Trae hasta 100 ml con agua
Diálisis	HEPES 20 mM, pH 7,9	HEPES 1M, pH 7,9	10 ml
	100 mM de KCl	3M KCl	16.625 ml
	0,2 mM de EDTA	0,5 M EDTA	200 l
	20% de glicerol	Glicerol	100 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM de PMSF	500 l
	0,5 mM de DTT	2M TDT	125 l
			Llevar hasta 500 ml con agua