Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

Resumen

En este protocolo, se muestran cómo construir cámaras personalizados que permitan la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa para activar el tiempo de imágenes a intervalos de cerebro adulto derivado translocación célula precursora neural durante galvanotaxia.

Resumen

El descubrimiento de células madre neurales y células progenitoras (colectivamente denominadas células precursoras neurales) (CPN) en el cerebro adulto de mamíferos ha conducido a un cuerpo de la investigación dirigida a la utilización de las propiedades multipotentes y proliferativa de estas células para el desarrollo de estrategias neuroregenerativas. Un paso crítico para el éxito de tales estrategias es la movilización de NPCs hacia un sitio de la lesión después de un trasplante exógeno o para aumentar la respuesta de los precursores endógenos que se encuentran en la región periventricular del SNC. Por consiguiente, es esencial para comprender los mecanismos que promueven, orientar y mejorar la migración NPC. Nuestro trabajo se centra en la utilización de los campos eléctricos de corriente directa (dcEFs) promover y migración NPC directa - un fenómeno conocido como galvanotaxia. Endógenos campos eléctricos funcionan como señales fisiológicas esenciales para la migración celular durante el desarrollo normal y la reparación de heridas. Interrupción farmacológica de latrans-neural en embriones de potencial tubo axolotl provoca graves malformaciones en el desarrollo ^1. En el contexto de la cicatrización de heridas, la tasa de reparación de córnea heridos se correlaciona directamente con la magnitud del potencial de heridas epiteliales que surge después de la lesión, como se muestra por la mejora farmacológica o la interrupción de este dcEF ^2-3. Hemos demostrado que los adultos NPCs subependimales someterse a migración catódica rápida y dirigida in vitro cuando se exponen a un dcEF aplicada externamente. En este protocolo se describen técnicas de nuestro laboratorio para la creación de un ensayo de galvanotaxia simple y eficaz para la alta resolución, observación a largo plazo de la translocación dirigida cuerpo celular (migración) en un nivel de una sola célula. Este ensayo sería adecuado para la investigación de los mecanismos que regulan la transducción de dcEF en la motilidad celular mediante el uso de ratones transgénicos o knockout, ARN corto de interferencia, o agonistas / antagonistas de receptores específicos.

Protocolo

Todos los procedimientos que impliquen la manipulación de animales fueron aprobados por la Universidad de Toronto Comité de Cuidado de Animales de acuerdo con las directrices institucionales (Protocolo n º. 20009387). Los siguientes métodos se debe realizar utilizando instrumentos estériles y técnicas, en una campana de flujo laminar en su caso.

En el texto siguiente protocolo, la frase "EFH-SFM" se refiere a medio libre de suero suplementado con factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico y la heparina. EFH-SFM se utiliza en la investigación de la galvanotaxia de NPCs no diferenciados debido a que estos mitógenos mantener NPCs en su estado indiferenciado ^4. Al investigar la galvanotaxia de NPCs inducidas a diferenciarse en tipos de células maduras, "FBS-SFM" se refiere a medio libre de suero suplementado con suero fetal bovino al 1%. FBS promueve la diferenciación de NPCs en maduros fenotipos neurales ^5.

1. Aislamiento y cultivo de precursores neurales (Nose muestra en vídeo)

1. Anestesiar un ratón CD1 (6-8 semanas) con isofluorano y el sacrificio por dislocación cervical.
2. Apaga la cabeza en 70% de etanol y decapitar al animal con tijeras de disección cortante.
3. Mientras sostiene la cabeza con fórceps quirúrgico, quitar la piel en la superficie dorsal para exponer el cráneo.
4. Utilizando un escalpelo y no. 11 blade, anotar el cráneo en el seno frontal a lo largo del eje mediolateral, y también a lo largo de la sutura sagital en la dirección rostrocaudal.
5. Pelar los huesos parietales lejos de la cabeza con no. 7 pinzas curvas, teniendo cuidado de no perforar el tejido cerebral.
6. Insertar una espátula fina debajo del cerebro a partir de debajo del cerebelo y avanzando hacia los bulbos olfatorios. Mientras sostiene el cráneo en su lugar con pinzas, tire suavemente del cerebro del cráneo y de inmediato se coloca en el hielo frío artificial líquido cefalorraquídeo (ver recetas a continuación).
7. Bajo un microscopio de disección, usando estériltijeras y pinzas de disección del cerebro cortar por la mitad a lo largo de la línea media. Gire cada hemisferio a fin de que la media (corte) de la superficie hacia arriba.
8. Seleccione un hemisferio, y con la superficie medial hacia arriba, busque el esplenio del cuerpo calloso (región posterior del cuerpo calloso).
9. Hacer una incisión en la superficie de la corteza de la rodilla del cuerpo calloso a lo largo del eje dorsoventral.
10. Pelar la corteza incisa hacia el bulbo olfatorio para exponer las paredes medial y lateral del ventrículo lateral.
11. Girar el hemisferio para que la superficie dorsal esté orientada hacia arriba, y el uso de micro tijeras curvadas para cortar y recoger las paredes expuestas medial y lateral, que contienen la región periventricular NPCs donde residen ^6.
12. Repita los pasos 1.8 a 1.11 para el otro hemisferio.
13. Pipetear el tejido aislado en 7 ml de solución de tripsina (ver receta a continuación) en un tubo de 15 cc, y coloque el tubo en un rockero en un 37 ° Cincubadora durante 25 min.
14. Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender el tejido en 2 ml de solución de inhibidor de tripsina (véase la receta a continuación).
15. Suavemente se tritura el tejido con una pipeta Pasteur de pequeñas perforaciones 30-50 veces con cuidado para evitar burbujas de aire.
16. Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender en 1-2 ml de SFM (ver receta más abajo) triturando el pellet 3-5 veces.
17. Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 3 min, aspirar el sobrenadante y se resuspende en 1 ml de SFM + EFH.
18. Contar vivir densidad de células con un hemocitómetro y la placa de las células en un matraz de cultivo T25 a una densidad de 10 células por microlitro en SFM + EFH.
19. Deje que la cultura a crecer durante 7 días no perturbados para producir flotan libremente neuroesferas primarias compuestas de NPCs.

2. Galvanotaxis cámara de preparación

1. Coloque 3 cristal cuadrado no. Un cubreobjetos (22 x 22 x 0,17 mm) ina botella de ácido clorhídrico 6 N durante la noche.
2. El día siguiente, utilizar una punta de diamante de cristal del cortador para cortar 6 tiras rectangulares (22 x 5 x 0,17 mm) de vidrio de no cuadrado. Un cubreobjetos.
3. Transfiera los resbalones cuadrados lavados con ácido e injertos rectangulares en una campana de flujo laminar. Lavar las tiras rectangulares y cuadradas primero con 70% de etanol, luego con el cultivo de tejidos de grado agua tratada en autoclave, y permitir que se seque en un Kim Wipe (para esterilidad añadido, el cristal se puede permitir que el aire seco).
4. Aplicar grasa de vacío para el perímetro de una superficie de las placas de vidrio cuadrados, y los sella a la base de 60 mm de placas Petri de plástico.
5. Aplicar grasa de vacío a lo largo del eje largo de una superficie de las tiras rectangulares de vidrio, y sellar los bordes opuestos de las placas de vidrio cuadrados (de forma que son paralelas entre sí) con el fin de crear un canal central.
6. UV-esterilizar las cámaras durante al menos 15 min en la campana de flujo laminar.
7. Pipetear 250-300 l de poli-L-Lysine en el canal central de las cámaras y se incuban a temperatura ambiente durante 2 h.
8. Aproximadamente 15 min antes de la finalización del periodo de incubación, preparar la solución de Matrigel (ver receta más abajo).
9. Aspirar el poli-L-lisina, se lavan los canales centrales con 1 ml de agua esterilizada, y la pipeta 250-300 l de solución de Matrigel en las depresiones centrales.
10. Incubar las cámaras a 37 º C durante 1 hr.
11. Aspirar la solución Matrigel y lavar suavemente los valles centrales con 1-2 ml de SFM.
12. Añadir 100 l de EFH-SFM SFM-FBS o en los valles centrales y la transferencia de las cámaras Galvanotaxis en el escenario de un microscopio contando.
13. Ml pipeta 3-4 de la cultura neurosphere que contiene en una placa de Petri de 60 mm y transferir la placa de Petri para la etapa del recuento con microscopio.
14. En un objetivo de visión de 5x, utilizar una pipeta para transferir P10 5-8 neuroesferas enteros (hasta cuatro a la vez) en el canal central de cada galvanotaxiacámara sin disociar, y extiende con cuidado las neuroesferas alrededor de la depresión central sin interrumpir el sustrato Matrigel.
15. Añadir un adicional de 150-200 l de EFH-SFM SFM-FBS o en los valles centrales.
16. Transferir las cámaras Galvanotaxis en un 37 ° C, 5% de CO _2, 100% incubador humidificado durante 17-20 horas (si el análisis de NPCs indiferenciadas) para permitir que las neuroesferas para adherirse al sustrato Matrigel y se disocian en células individuales como se muestra en la Figura 1 . Si el análisis de NPCs diferenciados, el período de incubación debe ser extendido a 69-72 horas para permitir la diferenciación de las células.

3. Vivo Celular Time-lapse de imágenes

1. Permitir que el sistema de células de imágenes en vivo se equilibre a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante un mínimo de 30 min antes de la iniciación de la grabación de lapso de tiempo.
2. Corte dos piezas de 12 cm de diámetro a 1 mm Plata alambre, la bobina de un lado, y colocarlos en Clorox blixiviación durante 20 minutos para formar Ag / AgCl electrodos.
3. Transferir las cámaras Galvanotaxis sobre la platina de un microscopio contar y seleccionar qué cámara se utilizan para análisis en vivo de células migración de imagen basado en los siguientes criterios: i) las neuroesferas debe ser casi completamente disocia en células individuales y ii) las células deben poseer morfologías circulares con poco o ningún proceso que se extiende desde los cuerpos celulares.
4. Transferir la cámara galvanotaxia seleccionado en una campana de flujo laminar, junto con un no cuadrado separado. 1 vaso cubreobjetos y grasa de vacío.
5. Lavar la tapa de deslizarse primero con 70% de etanol, luego con agua tratada en autoclave, y aplicar una tira de grasa de vacío en dos bordes paralelos de la hoja de cubierta.
6. Aspirar los medios de cultivo de la cubeta central de la cámara, a continuación, colocar rápidamente la hoja de la cubierta (grasa-lado que mira hacia abajo) en la cámara de tal manera que el resto grasa tiras de las dos tiras paralelas rectangulares de vidrio, creando efectivamente un techoa la cámara.
7. Añadir 100 l de nuevo EFH-SFM SFM-FBS o en la pila central a través de la acción capilar.
8. Use grasa de vacío para crear bordes de piscinas de medios de cultivo en cada extremo de la cubeta central, como se muestra en la Figura 2.
9. Cortar dos piezas de 15 cm de tubo de PVC, y utilizar una jeringa de 10 cc con una aguja de calibre 18 para inyectar cuidadosamente una solución de agarosa en el tubo, asegurándose de que no se forman burbujas en los tubos, y permitir que el gel solidifique durante 5 min.
10. Transferir la cámara galvanotaxia al sistema de células de imágenes en vivo, junto con los tubos de gel de agarosa, Ag / AgCl, y un par de vacío 60 mm placas de Petri que serán utilizados como medios de cultivo embalses y contendrá el Ag / AgCl. Permitir la cámara galvanotaxia a descansar dentro de la 37 ° C, 5% de CO ₂ ambiente durante 20-30 min.
11. Durante este tiempo, preparar las tapas de las cajas de Petri vacías 2 y la tapa de la cámara de cápsula de Petri galvanotaxia por los agujeros de perforaciónen ellos con una herramienta Dremel o similar como se muestra en la Figura 3.
12. Pipetear 1-1.5 ml de EFH-SFM o FBS SFM-en ambos lados de la depresión central, y 7-8 ml de SFM en cada placa de Petri vacía. Colocar una placa de Petri en cada lado del canal central de la cámara de galvanotaxia y coloque un electrodo Ag / AgCl en cada plato. Salvar la distancia entre la cámara de galvanotaxia y las placas Petri a establecer la continuidad eléctrica con los puentes en gel de agarosa, tal como se muestra en la Figura 4.
13. Conecte los electrodos de Ag / AgCl a una fuente de alimentación externa, con un amperímetro en serie para medir la corriente eléctrica y encienda la fuente de alimentación. Use un voltímetro para medir la fuerza del campo eléctrico directamente a través de la depresión central, y ajustar la salida de la fuente de alimentación hasta que la fuerza deseada de campo eléctrico se consigue (los ensayos realizados en este laboratorio utilizan una fuerza dcEF de 250 mV / mm con corriente eléctrica entre 1 y 1,5 mA).
14. IniciativaTE el módulo de lapso de tiempo en el sistema de células de imágenes en directo, y permitir el experimento para funcionar para la cantidad de tiempo deseada. Después de completar el ensayo, fijar las células en 4% de paraformaldehído para el análisis de inmunotinción estándar.

Resultados

Análisis cinemático revela que en presencia de un 250 mV / mm dcEF, NPCs indiferenciadas exponer galvanotaxia altamente dirigidos y rápido hacia el cátodo (Figura 5A, Película 1). En ausencia de un dcEF, movimiento al azar de las células se observó (Figura 5B, Película 2). En esta intensidad de campo,> 98% de NPCs indiferenciadas migrar para toda 6-8 hr para los que se explora, y ya que las células muertas no migran esto sugiere que permanecen viables durante este período e...

Discusión

Este protocolo ha sido adaptado de los métodos bien establecidos de estudios previos ^7-9. Galvanotactic cámaras pueden construirse utilizando una variedad de técnicas diferentes, incluyendo la construcción de un vaso separado bien para el confinamiento de la siembra de células, o el uso de CO ₂ ablación con láser para la microfabricación de la depresión central ^10,11. Algunas técnicas pueden ser más laborioso o costosos que otros. Se ha descrito un ensayo simple y rentable par...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del elemento	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			Precursoras neurales de aislamiento de células
2 M NaCl	Sigma	S5886	11,688 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
1 M KCl	Sigma	P5405	7,456 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
1 M MgCl 2	Sigma	M2393	20,33 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
155 mM NaHCO 3	Sigma	S5761	1,302 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
La glucosa 0,5 M	Sigma	G6152	9,01 g disueltos en 100ml dH 2 O
108 mM CaCl 2	Sigma	C7902	1,59 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15070
Tripsina de páncreas bovino	Sigma	T1005
Ovejas testículos hialuronidasa	Sigma	H6254
Ácido quinurénico	Sigma	K3375
Inhibidor de tripsina de ovomucoide	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% de glucosa	Sigma	G6152
7,5% NaHCO 3	Sigma	S5761
HEPES 1 M	Sigma	H3375	23,83 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
L-glutamina	Gibco	25030
FEAG	Invitrogen	PMG8041	Reconstituir en 1 ml de mezcla de la hormona y la alícuota en 20 unidades mu l.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstituir en 0,5 ml de mezcla de la hormona y la alícuota en 20 unidades mu l.
La heparina	Sigma	H3149
Apo-transferrina	R & D Systems	3188-AT	0,1 g disueltos en 4 ml de dH 2 0
Putrescina	Sigma	P7505	Disolver 9,61 mg en Apo-transferrina asíción
Insulina	Sigma	I5500	Disolver 25 mg en 0,5 ml de HCl 0,1 N y añade a 3,5 ml de dH 2 0
Selenio	Sigma	S9133
Progesterona	Sigma	P6149
Herramientas generales Dissection	Herramientas Artes Ciencias
Disección microscopio	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis cámara de preparación
Square portaobjetos de vidrio cubierta	VWR	16004
Ácido clorhídrico 6N	VWR	BDH3204-1
Grasa de alto vacío	Dow Corning
60 mm Placas de Petri	Fisher Scientific	0875713A
Poli-L-lisina	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Descongelar y alícuota en 150 unidades mu l
FBS	Invitrogen	10082139	Utilice únicamente si la inducción de diferenciación NPC, de lo contrario usar SFM + EFH medios de cultivo como se ha indicado anteriormente
Contando microscopio	Olimpo	CKX41
			Vivo Celular Time-lapse de imágenes
Alambre de plata	Alfa Aesar	11434
UltraPure agarosa	Invitrogen	15510-027
Calentar la inactividadATED FBS	Sigma	16140071
Tubería de PVC	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Blanqueador	Clorox
10 cc jeringa	BD	309604
Calibre 18 aguja	BD	305195
Dremel taladro	Dremel	Modelo 750
Microscopio invertido equipado con cámara de humidificado, incubados	Zeiss	Axiovert-200M
			Recetas Artículo Volumen 2 M NaCl 6,2 ml 1 M KCl 0,5 ml 1 M MgCl 2 0,32 ml 155mm NaHCO 3 16,9 ml La glucosa 1M 1 ml 108 mM CaCl 2 0,09256 ml Penicilina-estreptomicina 1 ml Agua autoclave 74 ml Líquido cefalorraquídeo artificial Artículo Volumen o Masa Líquido cefalorraquídeo artificial 30 ml Tripsina de páncreas bovino 40 mg Ovejas testículos hialuronidasa 22,8 mg Ácido quinurénico 5 mg solución de tripsina Artículo Volumen o Masa SFM 15 ml Inhibidor de tripsina de ovomucoide 10 mg Solución de inhibidor de tripsina Artículo Volumen Agua autoclave 37 ml 10 veces DMEM/F12 10 ml 30% de glucosa 2 ml 7,5% NaHCO 3 1,5 ml HEPES 1 M 0,5 ml Transferrina, putrescina solución 4 ml 25 mg solución de insulina 4 ml Selenio 100 y mu; L Progesterona 100 l Hormona Mix (100 ml en total, almacenan a -20 ° C) Artículo Volumen Agua autoclave 37,5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% de glucosa 1 ml 7,5% NaHCO 3 0,75 ml HEPES 1 M 0,25 ml Hormona de mezcla 5 ml L-glutamina 0,5 ml Penicilina-estreptomicina 0,5 ml Serum Free Media EFH-SFM: añadir 10 l de EGF, 10 l de FGF, y 3,66 l de heparina FBS-SFM: añadir 0,5 ml de FBS Artículo Volumen Matrigel 150 l SFM 3,6 ml Matrigel Solución alícuota Matrigel debe ser colocado en una caja de hielo y se dejó descongelar lentamente durante 4-5 horas para formar un líquido viscoso antes de mezclar con SFM. Esto asegurará la formación de una capa lisa de sustrato Matrigel. Si no descongelaron lentamente, el sustrato resultante contendrá grupos de Matrigel, posiblemente obstaculizar la migración celular. Artículo Volumen o Masa UltraPure agarosa 300 mg en 10 ml ddH 2 0 SFM FBS inactivado por calor 8 ml 2 ml MatrigelSolución Mezcle 8 ml de SFM con 2 ml de FBS inactivado por calor en un tubo de 15 cc halcón. Mezcla de agarosa con 10 ml ddH 2 0 en un matraz Erlenmeyer, y el calor en un horno de microondas durante 30 segundos en intervalos de 10-sec, asegurando para eliminar la solución del microondas después de cada intervalo de 10-sec y mezclar bien. Tras el final de 10 segundos período de microondas, mezclar la solución de agarosa con el SFM / solución de SFB y guárdelo en un baño de agua 57 ° C.