Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica

Riepilogo

In questo protocollo si dimostra come costruire camere personalizzate che consentono l'applicazione di un campo di corrente elettrica diretta a consentire time-lapse imaging del cervello adulto derivato neurale traslocazione cellula precursore durante galvanotaxis.

Abstract

La scoperta di staminali e cellule progenitrici (collettivamente chiamati cellule precursori neurali) (NPC) nel cervello dei mammiferi adulti ha portato ad un corpo di ricerca finalizzata ad utilizzare le proprietà multipotenti e proliferativi di queste cellule per lo sviluppo di strategie neurorigenerativo. Un punto critico per il successo di tali strategie è la mobilitazione di NPC verso un sito di lesione dopo trapianto esogena o per migliorare la risposta dei precursori endogeni che si trovano nella regione periventricolare del SNC. Di conseguenza, è essenziale per comprendere i meccanismi che promuovono, guidare, e migliorare la migrazione NPC. Il nostro lavoro si concentra su l'utilizzo di campi elettrici a corrente diretta (dcEFs) per la promozione e la migrazione diretta NPC - un fenomeno noto come galvanotaxis. Campi elettrici endogeni fisiologici operato come spunti critici per la migrazione delle cellule durante il normale sviluppo e la riparazione delle ferite. Interruzione farmacologica dellatrans-neurale potenziale tubo in embrioni axolotl causa gravi malformazioni dello sviluppo ^1. Nel contesto della guarigione delle ferite, il tasso di riparazione di cornea feriti è direttamente correlata con la grandezza del potenziale lesione epiteliale che sorge dopo la lesione, come mostrato dal miglioramento farmacologico o interruzione di questo dcEF ^2-3. Abbiamo dimostrato che adulti NPC subependimali incontro a rapida e diretta migrazione catodiche in vitro quando esposti ad un dcEF applicata esternamente. In questo protocollo si descrivono le tecniche del nostro laboratorio per la creazione di un saggio galvanotaxis semplice ed efficace ad alta risoluzione, osservazione a lungo termine della traslocazione cellula diretto del corpo (migrazione) su una singola cellula. Questo saggio sarebbe adatto per indagare i meccanismi che regolano la trasduzione dcEF in motilità cellulare attraverso l'uso di topi transgenici o knockout, brevi RNA interferenti, o agonisti dei recettori specifici / antagonisti.

Protocollo

Tutte le procedure che comportano il trattamento degli animali sono state approvate dal Comitato Università di Toronto Animal Care in conformità con le linee guida istituzionali (protocollo n. 20009387). I metodi seguenti devono essere effettuate utilizzando strumenti sterili e tecniche, in una cappa a flusso laminare dove applicabile.

Nel testo del protocollo sottostante, la frase "EFH-SFM" si riferisce a mezzi di informazione liberi siero integrato con il fattore di crescita epidermico, fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti e eparina. EFH-SFM viene utilizzato quando studiando la galvanotaxis di NPCs indifferenziate perché questi mitogeni mantenere NPC nel loro stato indifferenziato ^4. Quando si verifica il galvanotaxis di NPC indotte a differenziarsi in tipi di cellule mature, "FBS-SFM" si riferisce a mezzi di informazione liberi siero addizionato con 1% di siero fetale bovino. FBS promuove la differenziazione dei PNG in mature fenotipi neurali ^5.

1. Isolamento e la coltura dei precursori neurali (nonmostrato nel video)

1. Anestetizzare un topo CD1 (6-8 settimane) con isofluorano e sacrificio tramite dislocazione cervicale.
2. Spegnere la testa in etanolo al 70% e decapitare l'animale con le forbici affilate dissezione.
3. Mentre si tiene la testa con una pinza chirurgica, togliere la pelle sulla superficie dorsale per esporre il cranio.
4. Utilizzando un bisturi e non. 11 lame, segnare il cranio al seno frontale lungo l'asse medio-laterale, e anche lungo la sutura sagittale in direzione rostrocaudale.
5. Sbucciare le ossa parietali di distanza dalla testa senza. 7 pinze curve, facendo attenzione a non perforare il tessuto cerebrale.
6. Inserire una spatola sottile sotto il cervello a partire da sotto il cervelletto e avanzando verso i bulbi olfattivi. Tenendo il cranio in posizione con le pinze, tirare delicatamente il cervello dal cranio e subito mettere in ghiaccio freddo liquido cerebrospinale artificiale (vedi le ricette sotto).
7. Sotto un microscopio di dissezione, utilizzando steriledissezione forbici e pinze tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana. Ruotare ciascun emisfero in modo che il mediale (taglio) di superficie rivolta verso l'alto.
8. Selezionare un emisfero, e con la superficie mediale rivolta verso l'alto, individuare il splenio del corpo calloso (regione posteriore del corpo calloso).
9. Effettuare un'incisione dalla superficie della corteccia alla splenio del corpo calloso lungo l'asse dorsoventrale.
10. Sbucciare la corteccia incisa verso il bulbo olfattivo per esporre le pareti mediale e laterale del ventricolo laterale.
11. Ruotare l'emisfero in modo che la superficie dorsale rivolta verso l'alto, e usare microforbici curve per tagliare e raccogliere le pareti esposte mediale e laterale, che contengono la regione periventricolare dove PNG risiedono ^6.
12. Ripetere i passaggi 1,8-1,11 per l'altro emisfero.
13. Pipettare il tessuto isolato in 7 ml di soluzione di tripsina (vedi ricetta sotto) in un tubo da 15 cc, e posizionare il tubo su un agitatore a 37 ° Cincubatore per 25 min.
14. Centrifugare la provetta a 1500 rpm per 5 minuti, aspirare il surnatante, risospendere il tessuto e in 2 ml di soluzione di tripsina (vedi ricetta sotto).
15. Triturare delicatamente il tessuto con un piccolo pozzo pipetta Pasteur 30-50 volte con attenzione per evitare bolle d'aria.
16. Centrifugare la provetta a 1500 rpm per 5 minuti, aspirare il supernatante, e risospendere in 1-2 ml di SFM (vedi ricetta sotto) triturando il pellet 3-5 volte.
17. Centrifugare la provetta a 1.500 rpm per 3 minuti, aspirare il surnatante e risospendere in 1 ml di SFM + EFH.
18. Contare vivere densità delle cellule con un emocitometro e piastra le cellule in una beuta T25 coltura ad una densità di 10 cellule per microlitri di SFM + EFH.
19. Lasciare che la cultura di crescere per 7 giorni per ottenere indisturbati neurosfere primarie liberamente fluttuanti composti da NPC.

2. Galvanotaxis camera di preparazione

1. Mettere 3 vetro quadrato no. 1 vetrini coprioggetto (22 x 22 x 0.17 mm) ina bottiglia di acido cloridrico 6N overnight.
2. Il giorno successivo, utilizzare una punta di diamante di vetro taglierina per tagliare sei strisce rettangolari (22 x 5 x 0.17 mm) di vetro da nessuna piazza. 1 coperchio scivola.
3. Trasferire i tagliandi quadrati lavata con acido e marze rettangolari in una cappa a flusso laminare. Lavare le strisce rettangolari e quadrate prima con etanolo al 70%, poi con coltura tissutale acqua di grado autoclavato, e lasciare asciugare su un Kim Wipe (per sterilità aggiunto, il vetro può essere consentito di aria secca).
4. Applicare grasso per vuoto al perimetro di una superficie dei vetrini quadrati, e sigillare a base di piatti di plastica 60 millimetri Petri.
5. Applicare grasso per vuoto lungo l'asse di una superficie delle strisce rettangolari di vetro, e sigillare a bordi opposti dei vetrini quadrati (in modo che siano paralleli tra loro) in modo da creare una depressione centrale.
6. UV-sterilizzare le camere per almeno 15 min in cappa a flusso laminare.
7. Pipettare 250-300 microlitri di poli-L-lizzane sul canale centrale delle camere e incubare a temperatura ambiente per 2 h.
8. Circa 15 minuti prima della fine del periodo di incubazione, preparare la soluzione Matrigel (vedi ricetta sotto).
9. Aspirare il poli-L-lisina, lavare gli avvallamenti centrali con 1 ml di acqua autoclavato, e pipetta 250-300 microlitri di soluzione di Matrigel sulle depressioni centrali.
10. Incubare le camere a 37 ° C per 1 ora.
11. Aspirare la soluzione Matrigel e lavare delicatamente i trogoli centrali con 1-2 ml di SFM.
12. Pipettare 100 ul di EFH-SFM o FBS-SFM sulle depressioni centrali e trasferire le camere galvanotaxis sul palco di un microscopio di conteggio.
13. Pipetta 3-4 ml di neurosfere contenente coltura in piastre da 60 mm Petri e trasferire il piatto Petri alla fase del microscopio conteggio.
14. Ad un obiettivo di visualizzazione 5x, utilizzare una pipetta P10 trasferire 5-8 neurosfere interi (fino a quattro alla volta) sul canale centrale di ogni galvanotaxiscamera senza dissociare, e con cura diffondere le neurosfere di tutto il canale centrale, senza interrompere il substrato Matrigel.
15. Aggiungi un ulteriore 150-200 ml di EFH-SFM o FBS-SFM sulle depressioni centrali.
16. Trasferire le camere galvanotaxis in un 37 ° C, 5% di CO _2, 100% incubatore umidificato per 17-20 hr (se analizzando NPCs indifferenziate) per consentire la neurosfere di aderire al substrato Matrigel e dissociarsi in singole cellule, come mostrato in Figura 1 . Se l'analisi di NPC differenziati, il periodo di incubazione dovrebbe essere esteso per 69-72 ore per permettere la differenziazione delle cellule.

3. Live cellulare Time-Lapse Imaging

1. Permettono il sistema live cell imaging equilibrare a 37 ° C, 5% di CO ₂ per un minimo di 30 minuti prima dell'inizio del time-lapse.
2. Tagliate due 12 pezzi cm di 1 mm di diametro del filo d'argento, l'avvolgimento di bobine da un capo, e metterli in Clorox blisciviazione per 20 minuti per formare Ag / AgCl elettrodi.
3. Trasferire le camere galvanotaxis sul palco di un microscopio di conteggio e scegliere quale camera sarà utilizzato per live-cella di analisi di immagini di migrazione sulla base dei seguenti criteri: i) le neurosfere dovrebbe essere quasi completamente dissociato in singole cellule e ii) le cellule devono possedere morfologie rotondi con piccole-to-nessun processo si estende dai corpi cellulari.
4. Trasferire la camera selezionata galvanotaxis in una cappa a flusso laminare, con un no quadrato separato. 1 coperchio in vetro antiscivolo e grasso per vuoto.
5. Lavare il coperchio scivolare prima con etanolo 70%, poi con acqua autoclavata, e applicare una striscia di grasso per vuoto su due bordi paralleli del vetrino.
6. Aspirare il mezzo di coltura dalla vasca centrale della camera, quindi rapidamente posizionare il vetrino (grasso lato rivolto verso il basso) sulla camera di modo che il resto del grasso strisce sulle due strisce parallele rettangolari di vetro, creando un tettoalla camera.
7. Pipettare 100 ul di fresco EFH-SFM o FBS-SFM nella vasca centrale tramite azione capillare.
8. Utilizzare grasso per vuoto per creare bordi per piscine di terreni di coltura su ciascuna estremità del canale centrale, come mostrato in Figura 2.
9. Tagliate due 15 pezzi cm di tubo in PVC, e utilizzare una siringa da 10 cc con un ago da 18 gauge per iniettare con attenzione la soluzione di agarosio nel tubo, assicurando che nessun bolle si formano nei tubi, e permettere al gel di solidificare per 5 minuti.
10. Trasferire la camera galvanotaxis al sistema live imaging cellulare, insieme al gel di agarosio tubi, Ag / AgCl elettrodi, e un paio di piatti vuoti 60 millimetri Petri che verranno utilizzati come mezzi di coltura serbatoi e conterrà il Ag / AgCl elettrodi. Lasciare la camera galvanotaxis ad arrestarsi entro i 37 ° C, 5% di CO ₂ ambiente per 20-30 min.
11. Durante questo tempo, preparare i coperchi dei 2 piatti vuoti Petri e il coperchio della scatola di Petri della camera galvanotaxis da parte di foriin loro con un utensile Dremel o simile come mostrato in Figura 3.
12. Pipettare 1-1,5 ml di EFH-SFM o FBS-SFM su entrambi i lati del canale centrale, e 7-8 ml di SFM in ciascuna piastra di Petri vuota. Mettere una piastra di Petri su ciascun lato del canale centrale della camera galvanotaxis e mettere un Ag / AgCl in ogni piatto. Colmano il divario tra la camera galvanotaxis e le piastre di Petri di stabilire una continuità elettrica con i ponti gel agarosio, come mostrato in Figura 4.
13. Collegare le Ag / AgCl elettrodi a un alimentatore esterno, con un amperometro in serie per misurare la corrente elettrica, e accendere l'alimentazione. Utilizzare un voltmetro per misurare la forza del campo elettrico direttamente attraverso il trogolo centrale, e regolare l'uscita dell'alimentatore finché la forza desiderata campo elettrico viene ottenuto (i saggi effettuati in questo laboratorio utilizzano una forza dcEF di 250 mV / mm con corrente elettrica tra 1 e 1,5 mA).
14. Iniziativate il time-lapse modulo sul sistema live imaging cellulare, e che l'esperimento possa funzionare per il tempo desiderato. Dopo il completamento del test, fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per l'analisi immunoistochimica standard.

Risultati

Analisi cinematica rivela che in presenza di un mV / mm 250 dcEF, NPCs indifferenziate esporre galvanotaxis altamente orientati e rapido verso il catodo (figura 5A, Movie 1). In assenza di un dcEF, movimento casuale delle cellule si osserva (figura 5B, Movie 2). A questa forza di campo,> 98% di NPCs indifferenziate migrare per l'intero 6-8 hr per cui essi vengono esposte, e poiché le cellule morte non migrano questo suggerisce che essi rimangono vitali durante questo periodo, in...

Discussione

Questo protocollo è stato adattato da ben consolidati metodi di studi precedenti ^7-9. Camere Galvanotactic può essere costruito utilizzando una varietà di tecniche diverse, compresa la costruzione di un bicchiere ben separata per il confinamento di semina cellulare, o mediante ablazione laser CO ₂ per microfabbricazione del trogolo centrale ^10,11. Alcune tecniche possono essere più laborioso o costose di altre. Abbiamo descritto un test semplice e conveniente per la costruzione di un...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome della voce	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			Neural Precursore isolamento cellulare
2M NaCl	Sigma	S5886	11,688 g sciolti in 100 ml di dH 2 O
KCl 1M	Sigma	P5405	7,456 g sciolti in 100 ml di dH 2 O
1M MgCl 2	Sigma	M2393	20,33 g sciolti in 100 ml di dH 2 O
155 mm NaHCO 3	Sigma	S5761	1,302 g sciolti in 100 ml di dH 2 O
Glucosio 0.5M	Sigma	G6152	9,01 g sciolti in 100ml di dH 2 O
108 mM CaCl 2	Sigma	C7902	1,59 g sciolti in 100 ml di dH 2 O
Penicillina-streptomicina	Gibco	15070
Pancreas tripsina bovina	Sigma	T1005
Pecora testicoli ialuronidasi	Sigma	H6254
Acido Kynurenic	Sigma	K3375
Ovomucoid inibitore della tripsina	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucosio	Sigma	G6152
7,5% NaHCO 3	Sigma	S5761
HEPES 1M	Sigma	H3375	23,83 g sciolti in 100 ml di dH 2 O
L-glutammina	Gibco	25030
FEG	Invitrogen	PMG8041	Ricostituire in 1 ml di miscela di ormoni e aliquotare in 20 unità pl.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Ricostituire in 0,5 ml di miscela di ormoni e aliquotare in 20 unità pl.
Eparina	Sigma	H3149
Apo-transferrina	R & D Systems	3188-A	0,1 g sciolti in 4 ml di dH 2 0
Putrescina	Sigma	P7505	Sciogliere 9,61 mg in Apo-transferrina cosìluzione
Insulina	Sigma	I5500	Sciogliere 25 mg in 0,5 ml di HCl 0,1 N e aggiungere 3,5 ml di dH 2 0
Selenio	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Strumenti di dissezione standard	Strumenti Scienza Belle
Dissezione microscopio	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis camera di preparazione
Quadrati di vetro di copertura diapositive	VWR	16004
Acido cloridrico 6N	VWR	BDH3204-1
Vuoto Grasso per alte	Dow Corning
60 millimetri Petri piatti	Fisher Scientific	0875713A
Poli-L-lisina	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Scongelare e aliquotare in 150 unità pl
FBS	Invitrogen	10082139	Utilizzare solo se indurre il differenziamento NPC, altrimenti utilizzare SFM + terreni di coltura EFH come sopra indicato
Conteggio microscopio	Olimpo	CKX41
			Live cellulare Time-Lapse Imaging
Filo di argento	Alfa Aesar	11434
Ultrapura agarosio	Invitrogen	15510-027
Calore Inactivated FBS	Sigma	16140071
Tubi in PVC	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Candeggina	Clorox
Siringa da 10 cc	BD	309604
18 gauge	BD	305195
Dremel trapano	Dremel	Modello 750
Microscopio invertito dotato di umidificata, camera incubata	Zeiss	Axiovert-200M
			Ricette Voce Volume 2M NaCl 6,2 ml KCl 1M 0,5 ml 1M MgCl 2 0,32 ml 155mm NaHCO 3 16,9 ml Glucosio 1M 1 ml 108 mM CaCl 2 0,09256 ml Penicillina-streptomicina 1 ml Acqua autoclavata 74 ml Artificiale liquido cerebrospinale Voce Volume o massa Artificiale liquido cerebrospinale 30 ml Pancreas tripsina bovina 40 mg Pecora testicoli ialuronidasi 22,8 mg Acido Kynurenic 5 mg Tripsina Solution Voce Volume o massa SFM 15 ml Ovomucoid inibitore della tripsina 10 mg Inibitore della tripsina Solution Voce Volume Acqua autoclavata 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucosio 2 ml 7,5% NaHCO 3 1,5 ml HEPES 1M 0,5 ml Transferrina, putrescina soluzione 4 ml 25 mg soluzione di insulina 4 ml Selenio 100 & mu; L Progesterone 100 pl Ormone Mix (100 ml totali, conservare a -20 ° C) Voce Volume Acqua autoclavata 37,5 ml DMEM/F12 10X (3:1) 5 ml 30% Glucosio 1 ml 7,5% NaHCO 3 0,75 ml HEPES 1M 0,25 ml Ormone mix 5 ml L-glutammina 0,5 ml Penicillina-streptomicina 0,5 ml Siero Free Media EFH-SFM: aggiungere 10 ml di EGF, 10 pl di FGF, e 3,66 ml di eparina FBS-SFM: aggiungere 0,5 ml di FBS
Voce	Volume
Matrigel	150 pl
SFM	3,6 ml

Voce	Volume o massa
Ultrapura agarosio	300 mg in 10 ml DDH 2 0
SFM Calore FBS inattivato	8 ml 2 ml