Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

Resumen

Este estudio describe los procedimientos de instalación de un axón neuronal y la novela (astro) glia plataforma de co-cultivo. En este sistema de co-cultivo, la manipulación de la interacción directa entre un solo axón (y células gliales único) se hace factible, permitiendo un análisis mecanicista de la neurona mutuo de señalización gliales.

Resumen

Neurona adecuada a la interacción glia es fundamental para la función fisiológica del sistema nervioso central (SNC). Esta comunicación bidireccional está sofisticadamente mediada por vías de señalización específicas entre neuronas y glía ^1,2. Identificación y caracterización de estas vías de señalización es esencial para la comprensión de cómo neurona a la interacción glia formas CNS fisiología. Anteriormente, los cultivos de neuronas y células gliales mixtos han sido ampliamente utilizados para la prueba de las vías de señalización entre las neuronas y la glía. Lo que hemos aprendido de estos preparativos y otras herramientas in vivo, sin embargo, se ha sugerido que la señalización mutuas entre neuronas y glía ocurrieron a menudo en compartimentos específicos dentro de las neuronas (es decir, axón, dendrita, o soma) ^3. Esto hace que sea importante para desarrollar un nuevo sistema de cultivo que permite la separación de los compartimentos neuronales y, específicamente, examina la interacción entre células gliales y neuroNAL / axones dendritas. Además, el sistema de cultivo mixto convencional no es capaz de diferenciar los factores solubles y directos señales de contacto entre la membrana neuronal y glial. Además, la gran cantidad de neuronas y células gliales en el co-cultivo convencional sistema carece de la resolución necesaria para observar la interacción entre un solo axón y una célula glial.

En este estudio, se describe un axón y un sistema nuevos glia co-cultivo con el uso de una plataforma de cultura microfluídico (MCP). En este sistema de co-cultivo, las neuronas y las células gliales se cultivó en dos cámaras separadas que están conectadas a través de múltiples canales centrales. En esta plataforma de microfluidos cultura, sólo los procesos neuronales (especialmente los axones) puede entrar en el lado glial a través de los canales centrales. En combinación con el etiquetado potente proteína fluorescente, este sistema permite el examen directo de las vías de señalización entre las interacciones axonal / dendrítico y glial, tals axón mediada por la regulación transcripcional en células gliales, el tráfico del receptor mediada por células gliales en terminales neuronales y gliales mediada por el crecimiento del axón. El diámetro estrecho de la cámara también significativamente prohíbe el flujo del medio de neurona enriquecido en la cámara de glial, facilitando el sondeo de la membrana directa-proteína interacción entre axones / dendritas y superficies gliales.

Protocolo

1. Asamblea de la Cámara de Cultura Microfluidic (MCP)

1. MCP (Figura 1) son cámaras abiertas diseñado para culturas compartimentados de diferentes tipos de células ^4. Típicamente tiene dos compartimentos que están conectados a través de los canales centrales (3 m de diámetro). Asamblea del MCP con fondo de cristal platos es necesario para la preparación de las culturas y de análisis de imágenes posteriores.
2. En primer lugar, capa estériles con fondo de vidrio platos con poliornitina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) disuelto en tetraborato de sodio (Sigma-Aldrich, 10 mM, pH 8,5) y se incubaron durante la noche a 37 ° C.
3. Al día siguiente, los recubiertos con fondo de vidrio platos se lavaron tres veces con ddH ₂ O y se secó bajo la campana de ventilación estéril. Los platos de vidrio de fondo fueron entonces recubiertas adicionalmente con laminina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) y se secó bajo luz UV durante 1 hora. Platos recubiertos están listas para usar o se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso. Estos recubrimiento de unare necesario para las neuronas y astrocitos enchapado en el co-cultivo.
4. Para el montaje de la plataforma de la cultura, plataformas de microfluidos de cultivo se colocaron en la parte superior de los recubiertos con fondo de vidrio con platos centrales canales de conexión en su lado inferior para formar un sello hermético. Regular neurona o astrocito medios de cultivo se añadieron (a partir de las áreas de célula de recubrimiento) en ambos lados (Figura 1) en el ensamblado MCP y se incubaron durante 2-4 horas a 37 ° C, para asegurar que no hay fugas entre el MCP y de vidrio plato de fondo. Hemos probado con medio antes de células en placas para asegurar que no haya fugas. El conjunto de la MCP sobre el plato de fondo de vidrio deben estar recién preparadas antes de su uso.

2. Preparación de cultivo neuronal e inducción de los axones neuronales en ensamblado MCP

1. Cultivos de células neuronales corticales fueron recién preparada a partir de cerebros de ratón embrionarias 14-16 días de edad. El medio de cultivo neuronal se compone de medio neurobasal, 2% B27 neurobasasuplemento de l, 2 mM de glutamina mediante la adición de 1% de 100x GlutaMAX, y 1% de penicilina-streptomysin. Después de la disección del cerebro del ratón, las meninges se eliminó de la corteza bajo el microscopio de disección. El tejido se troceó a continuación, con una hoja de afeitar para hacer pequeños bloques de tejido con el fin de aumentar el área de superficie expuesta a la tripsina. Los bloques de tejido se trataron con tripsina (Sigma-Aldrich, 0,05% de tripsina) durante 10 minutos en un baño a 37 ° C, y luego disociarse suavemente por trituración con una pipeta Pasteur pulida al fuego. Las células disociadas se filtraron a través de un filtro 70 micras para recoger suspensión clara de las células neuronales.
2. Las neuronas (2-3 x 10 ⁶ / ml, 150 l) se sembraron en las áreas de célula de recubrimiento en el lado derecho (figura 1) de la MCP montado de modo que las neuronas pueden adjuntar en el área de retención celular (Figura 1). Neuronas recién preparados se sembraron con medio de chapado neurona que se complementa con 5% de suero fetal bovino (Hyclone) en la regulaciónr neurona medio de cultivo. Debido a que sólo las neuronas que se conectan en la zona de retención de células son capaces de crecer los axones en el otro lado de la MCP montado a través de los canales centrales, es importante la densidad de placa alto de neuronas en la zona de recubrimiento celular para asegurar suficientes neuronas están unidas a la célula área de retención. Una imagen representativa de alta densidad de axones neuronales se muestra en la Figura 2A.
3. Al día siguiente, el medio de recubrimiento neurona se sustituye por el medio de cultivo regular neurona. Cambio de medio se realizó por aspiración cuidadosamente el medio de la zona de revestimiento celular de la cámara, pero no de la zona de retención de células de la MCP montado, con el fin de evitar burbujas de aire en el área de retención de células y los canales de conexión central. Las burbujas de aire severamente inhibirá el axón y la posterior entrada en los canales centrales en el MCP. Glial de células factor neurotrófico derivado (GDNF, 10-20 ng / ml) se añadió también por el otro lado (izquierdo)de la cámara en el mismo día para facilitar la inducción del axón ⁵ desde el lado neuronal y transversal a través de los canales centrales de la MCP ensamblado (Figura 2A). Cantidad de crecimiento de las neuritas espontáneo sin GDNF también se observa desde el lado neuronal y transversal a través de los canales centrales de la MCP montado. Los axones que entran en el canal central se observan a menudo 2-3 días después de la siembra. Una vez que los axones entrar en el canal central, que generalmente entran en el otro lado en un día. Los axones son normalmente intacta durante al menos una semana después de entrar en el otro lado.

3. La adición de astrocitos en cultivo a MCP para establecer una compartimentado Co-cultura del sistema

Cultivos de astrocitos primarios se prepararon a partir del cerebro P1-3 de ratón cachorro. El procedimiento de disociación cerebro es similar al procedimiento de aislamiento de células neuronales se ha descrito anteriormente. Los astrocitos se cultivaron por primera vez en placa de 10 cm que se pre-Recubiertas con poliornitina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). El medio de cultivo de astrocitos (DMEM, 10% de suero bovino fetal, 1% de penicilina-streptomysin) se cambió cada día durante los siguientes dos días para eliminar los desechos. Después de eso, el medio se cambió cada tres días.

1. Los astrocitos convertido en 90% confluentes y formar una monocapa después de 7 días. Astrocitos confluentes se trataron con tripsina y 150 l de re-suspendidas astrocitos (1x10 ⁶ / ml) fueron re-chapada en la zona de recubrimiento de células de la parte izquierda de la ensamblada MCP cuando los axones están a punto de entrar o acaban de entrar en el lado izquierdo de el ensamblado MCP. Los astrocitos se sembraron por lo general 4-5 días después de que las neuronas eran plateado. GDNF se retiró antes de la primera re-recubrimiento de los astrocitos en el lado izquierdo de la MCP. Chapados Re-astrocitos se adjunta en el área de retención de células, tal como se muestra por la inmunotinción GFAP (Figura 1). Sólo flujo mínimo de medio entre ambos lados de las cámaras (determinado por fluorescencia dSí) se encontró en el MCP, como se mostró previamente ^4,6.
2. Los astrocitos convertido en 90% confluentes y formar una monocapa después de 7 días. Astrocitos confluentes se trataron con tripsina y 150 l de suspensión re-astrocitos (1 x 10 ⁶ / ml) fueron re-chapada en la zona de recubrimiento de células de la parte izquierda de la ensamblada MCP cuando los axones están a punto de entrar o acaban de entrar en la izquierda lado del ensamblado MCP. Los astrocitos se sembraron por lo general 4-5 días después de que las neuronas eran plateado. GDNF se retiró antes de la primera re-recubrimiento de los astrocitos en el lado izquierdo de la MCP. Chapados Re-astrocitos se adjunta en el área de retención de células, tal como se muestra por la inmunotinción GFAP (Figura 1). Sólo flujo mínimo de medio entre ambos lados de las cámaras (determinado por colorantes fluorescentes) se encontró en el MCP, como se mostró previamente ^4,6.
3. Después de la re-recubrimiento de los astrocitos, los axones que entraron en el lado izquierdo de la MCP montado interactúan directamente con la astrocytes, ya sea por contacto directo axonal o liberación de factores solubles. La inmunotinción de GLT1 astroglial membrana plasmática transportadora de glutamato neuronal y βIII de tubulina se realizó para visualizar la interacción entre los axones y astrocitos, como se muestra en la Figura 2D-F.

Resultados

Time-lapse de imágenes de análisis axón inducida por la activación del promotor GLT1 en astrocitos

La neurona de compartimentado y el sistema de co-cultivo de astrocitos permite sólo los procesos neuronales, especialmente los axones, para interactuar selectivamente con los astrocitos. Tras el establecimiento con éxito de axón y astrocitos (u otras células gliales) co-cultivo en el ensamblado MCP, diferentes tipos de interacciones gliales del axón puede ser estudiado como; axón inducid...

Discusión

La neurona MCP y basado en sistema de astrocitos de co-cultivo permite la disección de neurona detallada a astroglía vías de señalización permitiendo que sólo los axones pasan los canales centrales y la interacción con las células astrogliales. Este sistema de co-cultivo se puede configurar cómodamente con neurona convencional y los procedimientos de astrocitos cultura. También se describe una aplicación práctica de este sistema de co-cultivo mediante el empleo de un reportero eGFP base para demostrar axón ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
El suero fetal bovino	Hyclone	SH30070.03	para placas neurona por neurona medio cutlure
El suero fetal bovino	Sigma-Aldrich	F4135	por medio de cultivo de astrocitos
Glial nervio factor derivado	De I + D de sistemas	212-GD	Aplicar 10-20 ng / ml a lado de la cámara de neurona
Dulbecco modificado del águila de mediano alto de glucosa	Sigma-Aldrich	11995
70 mm filtro de células	BD Falcon	352350
Vidrio estéril plato de fondo	MatTek Corporación
Plataformas de microfluidos cultura	Xona microfluídica LLC	SND150
6 pocillos de la placa de cultivo	Cellstar	657 160
			Neurona medio de cultivo Medio Neurobasal 2% suplemento B27 Neurobasal 2 mM de glutamato mediante la adición de 1% 100x GlutaMAX 1% de penicilina-streptomysin
			Neurona medio de cultivo para la célula de recubrimiento Medio Neurobasal 2% suplemento B27 Neurobasal 2 mM de glutamato mediante la adición de 1% 100x GlutaMAX 1% de penicilina-streptomysin 5% de suero fetal bovino SH30070.03
			Medio de cultivo de astrocitos Dulbecco modificado eagle glucosa medio-alto 10% de suero fetal bovino F4135 1% de penicilina-streptomysin
			Materiales Tabla 1. Utilizados en el cultivo de microfluidos plataforma basada axón neuronal y glial sistema de co-cultivo.