Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Özet

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Özet

Glia etkileşim Uygun nöron merkezi sinir sistemi (MSS) fizyolojik fonksiyonu için önemlidir. Bu çift yönlü iletişim sophisticatedly nöron ve glia ^1,2 arasında belirli sinyal yolakları aracılık etmektedir. Bu sinyal yollarının tanımlanması ve karakterizasyonu glia etkileşim şekilleri MSS fizyolojisi nasıl nöronun anlayışı esastır. Önceleri, nöron ve glia karışık kültürlerin yaygın nöron ve glia arasındaki sinyal yolları test ve karakterizasyonu için kullanılmıştır. In vivo araçları bu müstahzarlar ve diğer öğrendim Ne Ancak, nöron ve glia arasında karşılıklı sinyalleşme sıklıkla nöronlar (yani, akson, dendrit veya soma) ³ içinde belirli bölümlerinde meydana geldiğini öne sürdü. Bu önemli nöronal bölmeleri ayrılması olanak sağlayan yeni bir kültür sistemi geliştirmek için yapar ve özellikle glia ve nöro arasındaki etkileşimi inceliyornal akson / dendrit. Buna ek olarak, geleneksel bir karışık kültür sisteminde çözünür faktörler ve nöron ve glia arasında doğrudan bir kontak sinyali ayırıcı zar yeteneğine sahip değildir. Ayrıca, geleneksel ko-kültür sisteminde nöronların ve glial hücreler ve büyük miktarda, tek bir akson ve bir glial hücre arasındaki etkileşimi gözlemlemek için gerekli çözünürlüğü yoksundur.

Bu çalışmada, bir mikroakışkan kültür platformu (MCP) kullanılması ile bir yeni akson ve glia ko-kültür sistemi açıklanmaktadır. Bu ko-kültür sisteminde, nöronlar ve glial hücreler birden santral kanallar aracılığıyla bağlanan iki ayrı odalarında kültüre. Bu mikroakışkan kültür platformu, sadece nöronal süreçleri (özellikle aksonlar) merkezi kanallardan glial tarafında girebilirsiniz. Güçlü floresan protein etiketleme ile birlikte, bu sistem, böyle bir akson / dendrit ve glial etkileşimler arasındaki sinyal yolakları, direkt bakı sağlarnöronal terminalleri glia, glia-aracılı reseptör ticareti, ve glia-aracılı akson büyüme ler akson-aracılı transkripsiyonel düzenleme. Odasının çapı önemli derecede dar akson / dendrit ve glial yüzeyler arasındaki doğrudan zar protein etkileşimi kolaylaştırmak sondalama, glial odasına nöron-zenginleştirilmiş orta akışını engeller.

Protokol

1. Mikroakışkan Kültür Odası Meclisi (MCP)

1. MCP (Şekil 1) hücreleri, ⁴ farklı bölmeli kültür için tasarlanan açık odaları vardır. Tipik olarak, merkezi kanal (çapı 3 um) ile bağlanmış iki bölmeden oluşmaktadır. Cam tabanlı yemekleri ile MCP Meclisi kültür ve sonraki görüntü analiz hazırlamak için gereklidir.
2. İlk olarak, Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ile kat steril cam tabanlı bir bulaşık sodyum tetraborat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8.5) içinde çözüldü ve 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edildi
3. Ertesi gün, kaplanmış cam tabanlı bir bulaşık GKD ₂ O ile üç kez yıkandı ve steril davlumbaz altında kurutulmuştur. Cam tabanlı tabaklar daha sonra daha fazla laminin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ile kaplanır, 1 saat için UV ışık altında kurutulmuştur. Kaplanmış bulaşık kullanıma hazır veya kullanıma dek -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Bu kaplamaco-kültür kaplama nöronların ve astrositler için gerekli yeniden.
4. Kültür platformu montajı için, mikroakışkan kültür platformları sıkı bir mühür oluşturmak için onun alt tarafında merkezi bağlayan kanalları ile kaplı cam zeminli yemeklerin üstüne yerleştirildi. Normal nöron veya astrosit kültür ortamlarda monte MCP her iki tarafı da (Şekil 1) (hücre kaplama alanlarından) eklendi ve 37 ° C'de 2-4 saat inkübe, MCP ve cam arasında hiçbir sızıntı olmadığından emin olmak için yapıldı dipli çanak. Biz hiçbir sızıntı olmadığından emin olmak için kaplama hücreleri önce orta ile test ettik. Cam dipli çanak MCP montajı taze kullanılmadan önce hazırlanmalıdır.

2. Montajlı MCP nöronal Aksonlar nöronal Kültür ve İndüksiyon hazırlanması

1. Kortikal nöronal hücre kültürleri taze embriyonik 14-16 günlük eski fare beyninden hazırlanmıştır. Nöron kültür ortamı neurobasal ortamı,% 2 B27 neurobasa oluşmaktadırl takviyesi, 100x GlutaMAX% 1 ve% 1 penisilin-streptomysin ekleyerek glutamin 2 mM. Fare beyin disseksiyon takiben, zarları mikroskop altında korteks çıkarıldı. Doku daha sonra tripsin ile maruz kalan yüzey alanını arttırmak için küçük doku blokları için bir jilet ile kıyılmış edildi. Doku blokları 37 ° C su banyosu içinde 10 dakika için (Sigma-Aldrich,% 0.05 tripsin) tripsinize ve bir ateş cilalı Pastör pipeti ile tritürasyon ile ayrılmış ve sonra yavaşça edildi. Disosiye berrak nöronal hücrelerin hücre süspansiyonu toplamak için bir 70 mikron filtre içinden filtre edildi.
2. Nöronların hücre tutma alanı (Şekil 1) bağlamak ve böylece nöronların (2-3 x 10 ⁶ / ml, 150 ul) toplandı MCP sağ tarafında (Şekil 1) hücre kaplama alanı üzerine ekildi. Taze hazırlanmış nöronlar düzenlemeler içine% 5 fetal sığır serumu (Hyclone) ile desteklenmiş nöron orta kaplama ile kaplanmıştırr nöron kültür ortamı. Hücre tutma alanında takmak sadece nöronlar merkezi kanaldan monte MCP diğer tarafına aksonlar büyümesi için gerekli olduğundan, yeterli nöron bağlı olan sağlamak için hücre kaplama alanında nöron plaka yüksek yoğunluk önemlidir hücre saklama alanı. Nöronal aksonların yüksek yoğunluklu bir temsilcisi, görüntü Şekil 2A'da gösterilmiştir.
3. Ertesi gün, nöron kaplama orta düzenli nöron kültür ortamı ile değiştirildi. Değişen ortam dikkatlice odasının hücre kaplama alanından orta aspirasyon ile gerçekleştirilir, ancak monte MCP hücre tutma alanı, hücre tutma alanı ve merkezi bağlantı kanalı içinde hava kabarcıkları önlemek için. Edildi Hava kabarcıkları ciddi MCP merkez kanal içine akson akıbet ve izleyen girdi inhibe olacaktır. Glial-hücresi kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF, 10-20 ng / ml), aynı zamanda, diğer (sol) tarafında eklendimonte MCP (Şekil 2A) merkez kanalları aracılığıyla nöronal yan ve çapraz akson akıbet ⁵ indüksiyonu kolaylaştırmak için aynı gün odasından. GDNF olmadan spontan akson uzantısı rayiç miktarı da monte MCP merkezi kanallardan nöronal yan ve çapraz görülmektedir. Merkez kanal içine girmek Aksonlar genellikle 2-3 gün sonra kaplama görülür. Aksonlar merkez kanal içine girdikten sonra, genellikle bir gün içinde diğer tarafı girin. Aksonlar diğer yan girdikten sonra, en az bir hafta süreyle normal olarak sağlamdır.

3. Bir Bölümlere Co-kültür Sistemi Kurmak MCP için Kültürlü astrositlerin eklenmesi

Primer astrosit kültürleri, P1-3 pup fare beyninden hazırlandı. Beyin ayrışma işlem yukarıda tarif edilen nöronal hücre izolasyon prosedürü ile aynıdır. Astrositler ilk ön edildi 10 cm çanak içine ekildiPolyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ile kaplanmıştır. Astrosit besiyeri (DMEM,% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomysin) enkaz kaldırmak için önümüzdeki iki gün boyunca her gün değiştirildi. Bundan sonra, ortam her üç günde bir değiştirildi.

1. Astrositler 90% konfluent haline ve 7 gün sonra bir tek tabaka oluştururlar. Konfluent astrositler tripsinize edildi ve akson yaklaşık girmek için olan ya da sadece sol tarafında içine girdikten sonra yeniden askıya alınmış astrositler (1x10 ⁶ / ml) 150 ul monte MCP sol tarafında hücre kaplama alanı içine yeniden ekildi MCP toplandı. Nöronlar kaplama vardı sonra astrositler genellikle 4-5 gün ekildi. GDNF birinci MCP sol tarafına astrositlerin yeniden kaplama önce çıkarıldı. Yeniden kaplama astrositler gibi immun GFAP (Şekil 1) gösterildiği gibi, hücre tutma bölgesinde bağlanmıştır. Odacıkların her iki tarafı arasında orta sadece asgari akım (d floresan ile belirlenirDaha önce ^4,6 gösterildiği gibi evet), MCP bulundu.
2. Astrositler 90% konfluent haline ve 7 gün sonra bir tek tabaka oluştururlar. Konfluent astrositler aksonlar yaklaşık girmek için veya sadece sol içine girmiş olduğu zaman monte MCP sol tarafında hücre kaplama alanı içine yeniden ekildi tripsinize ve yeniden asılı astrositler (1 x 10 ⁶ / ml) 150 ul edildi monte MCP tarafı. Nöronlar kaplama vardı sonra astrositler genellikle 4-5 gün ekildi. GDNF birinci MCP sol tarafına astrositlerin yeniden kaplama önce çıkarıldı. Yeniden kaplama astrositler gibi immun GFAP (Şekil 1) gösterildiği gibi, hücre tutma bölgesinde bağlanmıştır. Daha önce gösterildiği gibi, ^4,6 odacıkların her iki tarafı arasında orta sadece asgari akım (floresan boyalar ile belirlenen), MCP bulunmuştur.
3. Astrositlerin yeniden kaplama sonra, bir araya MCP sol tarafında girilen aksonların doğrudan doğruya astr ile etkileşimeDoğrudan aksonal temas veya çözünebilir faktörlerin salınımını biri tarafından ocytes. Astroglial plazma membranı glutamat taşıyıcı GLT1 ve nöronal βIII-tubulin immün Şekil 2D-F gösterildiği gibi, aksonların ve astrositler arasındaki etkileşimi görselleştirmek için yapıldı.

Sonuçlar

Astrositlerde akson indüklenen GLT1 organizatörü aktivasyon Time-lapse görüntüleme analizi

Bölmeli nöron ve astrosit ko-kültür sistemi sadece nöronal süreçleri, özellikle aksonlar, seçici astrositler ile etkileşim sağlar. Monte MCP içinde akson ve astrosit (veya diğer glial hücreler) ko-kültür başarılı kurulmasını takiben, akson-glia etkileşimleri farklı tür olarak ele alınabilir; Astroglial gen promoter aktivasyonu, astrosit indüklenen akson rehberlik akson ind?...

Tartışmalar

MCP tabanlı nöron ve astrosit ko-kültür sistemi sadece aksonlar merkez kanalları geçmesine izin ve Astroglial hücreleri ile etkileşerek astroglial sinyal yolları ayrıntılı nöronun diseksiyon sağlar. Bu ko-kültür sistemi rahatlıkla konvansiyonel nöron ve astrosit kültürü prosedürleri ile kurulabilir. Biz de Astrositlerde akson bağımlı GLT1 organizatörü aktivasyonu gösteren bir eGFP tabanlı muhabiri istihdam ederek bu ko-kültür sistemi pratik bir uygulama nitelendirdi.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovin serumu	Hyclone	SH30070.03	nöron cutlure orta nöron kaplama için
Fetal bovin serumu	Sigma-Aldrich	F4135	astrosit kültür ortamı için
Glial türetilen sinir faktörü	Ar-Ge sistemleri	212-GD	Odanın nöron tarafına 10-20 ng / ml Uygula
Dulbecco modifiye kartal orta yüksek glukoz	Sigma-Aldrich	11995
70 mm hücre süzgecinden	BD Falcon	352350
Steril cam alt tabak	Mattek Corporation,
Mikroakışkan kültür platformları	Xona Mikroakiskan LLC	SND150
Kültür plakasının 6 kuyu	Cellstar	657 160
			Neuron kültür ortamı Neurobasal orta % 2 B27 Neurobasal takviyesi % 1 100x GlutaMAX eklenmesi ile 2 mM glutamat % 1 Penisilin-streptomysin
			Kaplama hücre Nöron kültür ortamı Neurobasal orta % 2 B27 Neurobasal takviyesi % 1 100x GlutaMAX eklenmesi ile 2 mM glutamat % 1 Penisilin-streptomysin % 5 fetal sığır serumu SH30070.03
			Astrosit kültür ortamı Dulbecco modifiye eagle orta yüksek glukoz % 10 fetal bovin serumu F4135 % 1 Penisilin-streptomysin
			Mikroakışkan kültür platformu tabanlı nöronal akson ve glia ko-kültür sisteminde kullanılan Tablo 1. Malzemeler.