Vertical T-laberinto Choice Ensayo para la respuesta a los olores artrópodos

Resumen

Una vertical, laberinto en T olfatómetro se describe para el ensayo de la respuesta de comportamiento de los artrópodos. El olfatómetro permite al experimentador para medir las opciones realizadas por los sujetos del ensayo cuando a dos campos de olores potenciales. Tanto atracción y repulsión a partir de sustancias olorosas se pueden medir con este dispositivo.

Resumen

Dada la importancia económica de los insectos y arácnidos como plagas de cultivos agrícolas, los entornos urbanos o como vectores de enfermedades de plantas y humanos, diversas tecnologías están siendo desarrollados como herramientas de control. Un subconjunto de estas herramientas se centra en la modificación del comportamiento de los artrópodos por atracción o repulsión. Por lo tanto, los artrópodos son a menudo el foco de las investigaciones del comportamiento. Diversas herramientas se han desarrollado para medir el comportamiento de los artrópodos, incluyendo túneles de viento, molinos de vuelo, servospheres, y varios tipos de olfatómetros. El propósito de estas herramientas es para medir la respuesta del insecto o arácnido a las señales visuales o más a menudo olfativo. La vertical T-laberinto oflactometer descrito aquí mide elecciones realizadas por los insectos en respuesta a atrayentes o repelentes. Se trata de un dispositivo de ensayo de alto rendimiento que se aprovecha de la phototaxis positivo (atracción a la luz) y negativos (geotaxis tendencia a caminar o volar hacia arriba) exhibidas por muchos artrópodos. El olfactometer consiste en un tubo de vidrio de 30 cm que se divide por la mitad con una tira de teflón formando un laberinto en T. Cada mitad sirve como un brazo del olfatómetro que permite a los sujetos de prueba para hacer una elección entre dos campos de olores potenciales en ensayos que implican atrayentes. En los ensayos que implican repelentes, la falta de respuesta normal a los atrayentes conocidos también se puede medir como una tercera variable.

Introducción

Los artrópodos (incluidos los insectos y arácnidos) se define a menudo como plagas, ya sea porque compiten con el consumo humano en entornos agrícolas o urbanos o transmitir agentes patógenos causales de la enfermedad ^1. Una gran cantidad de inversión se realiza en el desarrollo de herramientas de control de plagas. Estas herramientas pueden variar ampliamente y se han logrado importantes avances en el desarrollo biorracionales herramientas que, o bien modificar o explotar el comportamiento natural de las plagas con el uso de atrayentes o repelentes de comportamiento ^2,3.

Plagas de artrópodos suelen basarse en las señales olfativas o señales de pareja y / o host ubicación ^4. Por lo tanto, el descubrimiento de atrayentes o repelentes eficaces para las plagas a menudo puede conducir al desarrollo de herramientas de control. Este proceso de descubrimiento implica varios pasos. En primer lugar, el comportamiento natural del sujeto de prueba debe ser entendido. Por ejemplo, uno debe determinar si un sexo de una especie dada atrae el opuestosexo por ubicación mate. Si es así, se debe determinar si esta atracción está mediada por un producto químico y donde química que se produce. Otros pasos incluyen la determinación de si la sustancia química que se produce y su eventual identificación. A lo largo de este procedimiento, el sujeto de prueba (de insectos o ácaros) respuesta de comportamiento a los olores debe ser probado. Inicialmente, el comportamiento del sujeto de ensayo se probará para el material natural. Por ejemplo, la respuesta de una polilla macho puede ser analizada para que la del extracto de su misma especie hembra de la glándula de feromonas. Por otra parte, la respuesta de un herbívoro a los olores naturales de su planta hospedante puede ser probado. Mientras que estas investigaciones tienen un enfoque práctico en el desarrollo de herramientas de gestión de ^5,6, también se puede aplicar a la investigación que se ocupa de cuestiones más fundamentales, tales como la especiación ^7. Los pasos siguientes implican probar la respuesta del artrópodo para determinadas versiones sintéticas de productos naturales.

Untender artrópodos cómo responder a los productos químicos requiere el desarrollo de herramientas adecuadas para medir su comportamiento. Los datos generados por estos instrumentos dependerá de lo bien que el investigador es capaz de medir los comportamientos naturales en un entorno controlado. Más de seis décadas, olfatómetros sostenidos de vuelo y túneles fueron desarrollados para medir la respuesta de los insectos a los olores ^8,9. Olfatómetros variar significativamente en diseño y están sujetos a los insectos o problema específico se está investigando. El objetivo de este artículo es describir el diseño y el uso de una orientación vertical, T-laberinto olfatómetro para medir la respuesta de los insectos a los olores (Figura 1). La orientación vertical olfatómetro se aprovecha de la geotaxis negativo (tendencia a moverse hacia arriba) exhibida por muchos insectos. Una fuente de luz situada directamente encima de la olfatómetro se aprovecha de la phototaxis positivo (tendencia a moverse hacia la fuente de luz) exhibido por muchos insectos. El olfactometer es particularmente útil para insectos hemípteros que tienden a no exhibir movimiento fácilmente en olfatómetros orientados horizontalmente y que están muy influenciados por la intensidad de la luz con respecto a la orientación. Sin embargo, este dispositivo se puede utilizar para una amplia gama de insectos voladores y rastreros, así como arácnidos. El olfatómetro puede emplearse para evaluar tanto los atrayentes y repelentes. En el caso de los atrayentes, el campo olor bifurcada (Figura 1) se establece con el atrayente putativo liberado en un lado versus aire limpio liberada en el lado opuesto. Una selección es registrada cuando el insecto liberado en la base del olfatómetro elige uno de los dos campos de olor. En el caso de repelentes, un comportamiento tercero es posible. Además del movimiento hacia arriba en cualquiera de los dos campos de olor, la falta de movimiento hacia arriba puede estar grabada que indica un estímulo que no responde o repeler estímulo de los campos de olor sea.

Protocolo

1. Montaje de un diseño personalizado, de dos puertos dividido T-olfatómetro se ha descrito previamente en Mann et al. ¹⁰ se muestra en la figura 1. El olfatómetro consiste en un tubo de vidrio de 30 cm que se bifurca en dos puertos separados con una tira de teflón formando un laberinto en T. Cada mitad es análogo a un brazo de un olfatómetro estilo 2-opción que permite al sujeto de prueba para elegir entre dos campos de olores potenciales.
   1. Los ensayos de montaje y posterior debe tener lugar dentro de una habitación con temperatura controlada o cámara ambiental.
   2. Mount vidrio laberinto en T olfatómetro verticalmente como se muestra en la Figura 1 y colocarlo debajo de una bombilla de luz fluorescente 900 lux.
   3. Para la difusión óptima de la luz, la asamblea debe ser montado en un 1,0 x 0,6 x 0,6 m recipiente opaco para maximizar la difusión uniforme de la luz.
   4. Conectar los brazos olfatómetro a fuentes de olor que se alojarán en fase sólida micro-extracción fuente chamb explotación / olorer (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville, FL) a través de teflón, conectores de tubo de vidrio. Cada SPMEC se compone de un tubo de vidrio recto (17,5 cm de largo x 3,5 cm de ancho) apoyado con una entrada y una válvula de salida para las corrientes de aire entrante y saliente (Figura 1).
   5. Conectar el sistema de suministro de aire a una fuente externa de aire humidificado y purificado de carbono-que está bajo presión constante (el sistema de suministro de aire tiene tanto un filtro de carbono interno para la purificación de aire y un burbujeador de aire para la humidificación de fuentes externas si están disponibles).
   6. Disolver muestras químicas deseadas dentro de diluyente apropiado (disolvente) y pipeta sobre un sustrato de liberación lenta tal como una mecha de algodón (John Petty Packaging, Inc., Concord, NC). El tratamiento de control debe constar de una mecha de algodón impregnado con disolvente solo.
   7. Para evitar la contaminación significativa de la cristalería, envuelven las mechas de algodón tratados y de control en el tejido de laboratorio (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) y ponerlo en los dos brazos SPMEC (ARS, Inc., Gainesville, FL). En el caso de muestras de plantas vivas, una cámara de recogida de guillotina volátil puede estar unido a la olfatómetro contiene tratamientos en lugar de la SPMEC (Figura 1).
   8. Entregar purificado y aire humidificado a través de la SPMEC (o cámara de guillotina volátil) a través de dos bombas conectadas a un sistema de suministro de aire (Figura 1). Mantener la tasa de flujo de aire a 0,1 L / min a través de ambos brazos del olfatómetro.
2. Empleando olfatómetro para probar la respuesta a los repelentes de artrópodos putativo. En la presente descripción, un insecto hemíptero, psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri, se utilizó como un artrópodo prueba. Respuesta fue probado a volátiles de cítricos solos o en combinación con un (disulfuro de dimetilo) y repelente de aire limpio como fuentes de olor.
   1. Llevar a cabo todos los experimentos a una temperatura normalizada y la humedad relativa.
   2. Antes de todas las pruebas, exponer test temas para limpiar el aire acondicionado o aire limpio en comparación con solvente limpio en comparación con el olfatómetro T-laberinto para verificar la ausencia de sesgo posicional o un efecto del solvente sobre la conducta del sujeto de prueba.
   3. Asignar una fuente de olor al azar a uno de los brazos del olfatómetro al comienzo de cada bioensayo. Invertir esta posición después de cada 10 sujetos de prueba ensayadas, como mínimo, para eliminar el potencial de sesgo posicional.
   4. Pon a prueba la respuesta de un mínimo de 30 (y hasta 120) sujetos de prueba por combinación del tratamiento.
   5. Permita que los sujetos de prueba 100-300 sec para exhibir una respuesta de comportamiento basado en la respuesta previamente establecida (latencia) intervalo.
   6. Record si el sujeto entra en el brazo de tratamiento, o brazo de control permanece en el puerto de liberación o por debajo de la división T-laberinto.
   7. Puntuación elegir brazo de tratamiento o de control cuando un sujeto de prueba cruza la división en el laberinto en T y se mueve en cualquiera de los brazos olfatómetro.
   8. Marca un brazo de liberación elección cuando una prueba sSujeto permanece en el puerto de liberación o por debajo de la división T-laberinto.
   9. Limpiar el olfatómetro y tubos de conexión a fondo con solución de jabón 2% y hornear los componentes de vidrio a 200 ° F entre el uso de tratamientos de olor diferentes.
   10. Para los ensayos en los que putativo tratamientos repelentes se presentan en el olfatómetro laberinto en T con o sin un tratamiento químico en comparación con el aire limpio, comparar el número de sujetos de prueba restantes en el punto de descarga, y no entrar en el olfatómetro entre los tratamientos por una forma de análisis de varianza ( ANOVA) seguido por el test HSD de Tukey (α <0,05). En los casos en los que los sujetos de prueba dejan el brazo de liberación, comparar el número de la elección del brazo de control versus el grupo de tratamiento con Chi cuadrado (χ ²⁾ análisis en α <0,05.

Resultados

Atracción de psílidos asiáticos de cítricos (Diaphorina citri) adultos a los olores de sus volátiles natales de plantas hospederas (cítricos) se representa en la figura 2A. Los adultos de manera significativa (α <0,05) más eligió el brazo del olfatómetro laberinto en T recibir los olores de las plantas de cítricos que viven en comparación con un blanco (aire limpio) de control.

Un ejemplo de repulsión se muestra en la Figura 2B. En este caso, los insectos fueron expuestos a un brazo de los volátiles de cítricos laberinto T-receptores, mientras que el segundo brazo recibido volátiles a partir de una planta de cítricos que se trató con el conocido disulfuro repelente, dimetil ^11. En este caso, tres tipos de comportamientos fueron observados. El número de psílidos detenidos en el brazo de liberación y que no responden no fue diferente estadísticamente del número que entra en el brazo de la recepción de los olores de las plantas de cítricos sola (Figura 2B). Sin embargo, no psílidos entrado en el brazo que contiene tque acogerá la planta volátil cuando co-presentó con el repelente (Figura 2B).

Figura 1. Diagrama esquemático de la orientación vertical laberinto en T olfatómetro se unió a sistema de suministro de aire y los dispositivos de tratamiento de olores de liberación. El diagrama es una adaptación de la figura 1 en Mann et al. ^10. Un sujeto de ensayo se colocaron individualmente en la cámara de liberación de la 2-puerto dividido T-olfatómetro. Se mueve hacia los olores a través de una válvula de compuerta que permite el movimiento controlado hacia arriba en el olfatómetro y evita que el insecto se arrastra de nuevo en el área del punto de liberación. El tubo se bifurca 10 cm después del valor de entrada. Una respuesta positiva a un olor se graba una vez que el insecto se mueve 0,5 cm en un lado específico de la división. La cámara de guillotina colección volátil puede ser utilizado en lugar de un sólido PHAse micro-extracción explotación / cámara de olor fuente (SPMEC) como una fuente de olor.

Figura 2. Respuesta de asiáticos psílido de los cítricos (Diaphorina citri) adultos a volátiles de plantas hospedantes cítricos versus un control de aire limpio (A) o volátiles de cítricos contra los volátiles de cítricos co-editado con un (disulfuro de dimetilo) repelente (B) en una orientación vertical T -laberinto olfatómetro Figura 2A:. Una forma de análisis de varianza (ANOVA) seguido por el test HSD de Tukey (α <0,05) se realizó para comparar el número de psílido hacer una elección entre cualquiera de los brazos (2 tratamientos, n = 120). Las columnas indicadas por letras diferentes son significativamente diferentes de otro (α <0,05) una figura 2B:. Unidireccionales analyses de la varianza (ANOVA) seguido por el test HSD de Tukey (α <0,05) se realizó para comparar el número de psílido hacer una elección entre cualquiera de los brazos o la permanencia en el punto de liberación (3 tratamientos, n = 120). Las columnas indicadas por letras diferentes son significativamente diferentes uno del otro (α <0,05).

Discusión

En la presente memoria, un dispositivo de ensayo y el protocolo se ha descrito para la medición de la respuesta de los artrópodos pequeños (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) a odorantes. El método implica una prueba de elección, permitiendo que el insecto que hacer una elección entre dos campos odorantes en el caso de los ensayos de evaluación de un atrayente putativo. Por otra parte, el sujeto de prueba puede mostrar tres tipos de comportamientos dejando el brazo de liberación y entrar uno de los dos campos potenciales de olor, o que permanece en el brazo de liberación, en el caso de los ensayos de repelencia. El olfatómetro permite un alto rendimiento de recolección de datos, ya que se aprovecha de la geotáctico negativo (tendencia a moverse hacia arriba) y fototácticas positivo (tendencia a moverse hacia la luz) respuesta de comportamiento natural de muchos artrópodos. Aunque la manifestación presente ejemplo utiliza un insecto de prueba psílido, el ensayo puede ser fácilmente adaptado a los artrópodos en general, tanto los que utilizan vuelo o caminar como modos predominantes de transporte.

olfatómetros diseñados para medir la respuesta de los insectos fueron inicialmente desarrollados hace décadas y han desempeñado un papel importante en la aclaración de los atrayentes y repelentes de insectos ^12. Los diseños específicos de olfatómetros pueden variar ampliamente, sin embargo, variaciones sobre el tema general de el ensayo de dos elección descrito aquí, así como, de tubos similar Y-ensayos se han utilizado a menudo para medir la respuesta de artrópodos a los productos químicos. Túneles más grandes de vuelo que pueden causar vuelo sostenido de insectos ⁹ también han dado lugar a la recopilación de datos innovadores elucidar los mecanismos fundamentales de vuelo de los insectos y la orientación de semioquímicos, así como, datos informando uso práctico de las herramientas de control de plagas.

A menudo es necesario adaptar el diseño a un olfatómetro e instrumentación asociada para la biología del sujeto de la prueba específica de artrópodos. Esos olfatómetros que se pueden utilizar entre un grupo general de los insectos son más útiles que los specific a un pequeño grupo, sin embargo, a veces la importancia económica de un reducido grupo de insectos que dicta la necesidad del desarrollo de un olfatómetro muy específica y técnica de ensayo. El diseño describe actualmente se basa en técnicas de artrópodos anteriormente conocidas. Además, permite una mayor elección estándar de dos tubos de ensayo de bioensayos Y-en el que el recinto experimental o prueba de elección toma la forma de un dispositivo de cristal en forma de Y ^7. Típicamente, un brazo de un tubo en Y recibirá un odorante tratamiento, mientras que el otro será dejado en blanco ^13. Variaciones sobre olfatómetros tales pueden incluir la adición de múltiples brazos radiales ¹⁴ e incluso la adición de un medio de suelo para someter a ensayo el comportamiento de los organismos que se desplazan a través del suelo ^15. En el desarrollo de tales olfatómetros y ensayos asociados, es importante considerar cómo de cerca las condiciones naturales se replican y por lo tanto la verdadera relevancia de las respuestas conductuales evaluados en términos de biología los sujetos de prueba. A una la-rge grado, los datos recogidos sólo serán tan útiles como la relevancia del bioensayo de comportamiento con respecto a la ecología del comportamiento del organismo ^16.

El olfatómetro actualmente descrito y bioensayo de comportamiento está diseñado específicamente para un insecto hemíptero que tiende a iniciar el vuelo como cortas "saltos" ^16. La orientación vertical de la olfatómetro y la disposición de fuente de luz facilitar el inicio de movimiento de los insectos y por tanto, posterior químicamente mediada comportamiento de orientación se pueden ensayar de manera eficiente y con un alto rendimiento. Esta disposición ensayo de conducta probablemente se puede utilizar para una amplia gama de volar o caminar taxones de artrópodos o podría ser también fácilmente modificados para adaptarse a la necesidad de no artrópodos organismos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del Equipo	Empresa	El número de catálogo	Comentarios
Dos puertos dividido T-olfatómetro	Analytical Systems Research (ARS), Inc. Gainesville, FL	Ninguno (por encargo)	Si no está disponible a partir de ARS, Científica del Sur (Gainesville, FL) también actualmente construye y distribuye equipos.
En fase sólida micro-extracción explotación / cámara de fuente de olor con Teflon;-conectores de tubo de vidrio.	Analytical Systems Research (ARS), Inc. Gainesville, FL	RV-R3	Véase el comentario
Sistema de aire de suministro	Analytical Systems Research (ARS), Inc. Gainesville, FL	HADS-2AFM2C.4	Véase el comentario
Guillotina cámara	Analítica Researco Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	L3GP3	Véase el comentario