Verticale T-maze test di scelta per risposta artropodi di odori

Riepilogo

Una verticale, T-labirinto olfattometro è descritto per saggiare la risposta comportamentale degli artropodi. Il olfattometro permette allo sperimentatore di misurare le scelte effettuate da soggetti di prova quando è sottoposto a due campi odore potenziali. Sia attrazione e repulsione per da odoranti può essere misurata con questo dispositivo.

Abstract

Data l'importanza economica di insetti e aracnidi come parassiti delle colture agricole, ambienti urbani o come vettori di impianti e malattie umane, diverse tecnologie sono in fase di sviluppo come strumenti di controllo. Un sottoinsieme di questi strumenti si concentra sulla modifica del comportamento di artropodi di attrazione o repulsione. Pertanto, artropodi sono spesso al centro delle indagini comportamentali. Vari strumenti sono stati sviluppati per misurare il comportamento degli artropodi, tra cui gallerie del vento, mulini volo, servospheres, e vari tipi di olfactometers. Lo scopo di questi strumenti è quello di misurare la risposta di insetti o aracnidi di segnali visivi o più spesso olfattiva. Il labirinto verticale T-oflactometer qui descritto le misure scelte operate da insetti in risposta a attrattivi o repellenti. Si tratta di un dispositivo ad alta velocità saggio che si avvale della fototassi positiva (attrazione per la luce) e negativi (geotassi tendenza a camminare o volare verso l'alto) presentati dai molti artropodi. Il olfactometer è costituito da un tubo di vetro 30 cm che è divisa a metà con una striscia di Teflon formando una T-labirinto. Ogni metà funge da braccio del olfattometro consentire ai soggetti di prova a fare una scelta tra due campi odore potenziali test che coinvolgono attrattivi. In saggi coinvolgono repellenti, mancanza di risposta normale attractants noti possono anche essere misurata come una terza variabile.

Introduzione

Artropodi (inclusi gli insetti e aracnidi) sono spesso definiti come parassiti, perché sia in concorrenza con l'alimentazione umana in ambienti agricole o urbane o trasmettere agenti patogeni causali della malattia ^1. Una grande quantità di investimento è fatto in sviluppo di strumenti di controllo per tali pesti. Questi strumenti possono variare ampiamente e notevoli progressi sono stati compiuti nello sviluppo di strumenti biorational che o modificano o sfruttare il comportamento naturale dei parassiti con l'uso di esche comportamentali o repellenti ^2,3.

Parassiti artropodi spesso si basano su segnali olfattivi o spunti per accoppiarsi e / o l'host posizione ^4. Pertanto scoperta di attrattivi o repellenti efficaci per i parassiti possono spesso portare allo sviluppo di strumenti di controllo. Questo processo di scoperta prevede diversi passaggi. In primo luogo, il comportamento naturale del soggetto di prova deve essere compreso. Per esempio, si deve accertare se un sesso di una specie attira l'oppostosesso per posizione di un accoppiamento. In caso affermativo, si deve determinare se questa attrazione è mediata da una sostanza chimica e dove la sostanza chimica viene prodotta. Ulteriori passi sono determinare quando la sostanza chimica viene prodotta e la sua identificazione finale. Tutta questa procedura, il soggetto stesso (insetti o acari) risposta comportamentale odoranti deve essere testato. Inizialmente, il comportamento del soggetto di prova saranno testati per il materiale naturale. Per esempio, una risposta falena maschio può essere testato a quella dell'estratto della sua conspecific femmina ghiandola feromone. In alternativa, la risposta di un erbivoro per gli odori naturali della sua pianta ospite può essere provato. Mentre queste ricerche hanno spesso un orientamento pratico sullo sviluppo di strumenti di gestione ^5,6, possono anche essere applicate alla ricerca che affronti questioni fondamentali, come speciazione ^7. I passi successivi riguardano testare la risposta del artropode di versioni sintetiche di prodotti naturali identificati.

Understanding artropodi come rispondere agli agenti chimici è necessario lo sviluppo di strumenti adeguati per misurare il loro comportamento. I dati generati da questi strumenti dipende dal modo in cui il ricercatore è in grado di misurare i comportamenti naturali in un ambiente controllato. Più di sei decenni fa, olfactometers volo prolungato e gallerie sono stati sviluppati per misurare la risposta degli insetti al ^8,9 odoranti. Olfactometers variano in modo significativo nel design e sono spesso su misura per l'insetto o problema specifico oggetto di indagine. L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere la progettazione e l'uso di un orientamento verticale, T-labirinto olfattometro per misurare la risposta insetto odori (Figura 1). L'orientamento verticale olfattometro prende vantaggio dalla geotassi negativo (tendenza a spostarsi verso l'alto) esposti da molti insetti. Una sorgente di luce posizionata direttamente sopra la olfattometro sfrutta la phototaxis positivo (tendenza a muoversi verso la fonte di luce) esibita da molti insetti. Il olfactommetro è particolarmente utile per gli insetti hemipteran che tendono a non esporre il movimento facilmente in olfactometers con orientamento orizzontale e che sono fortemente influenzati dalla intensità della luce in relazione all'orientamento. Tuttavia, questo dispositivo può essere utilizzato per una vasta gamma di insetti volanti e striscianti, nonché aracnidi. Il olfattometro può essere impiegato per valutare sia attrattivi e repellenti. Nel caso di attrattivi, campo odore biforcato (Figura 1) è stabilito con la attractant putative rilasciato su un lato contro aria pulita rilasciato sul lato opposto. Una scelta viene registrata quando l'insetto rilasciato alla base del olfattometro sceglie uno dei due campi odore. Nel caso di repellenti, un terzo comportamento è possibile. Oltre al movimento verso l'alto in uno dei due campi odore, mancanza di movimento verso l'alto può essere registrato indicando un non-reattivo stimolo o respingere stimolo da entrambi i campi odori.

Protocollo

1. Montaggio di un design personalizzato, due porte divisa T-olfattometro precedentemente descritto Mann et al. ¹⁰ è mostrato in Figura 1. Il olfattometro costituito da un tubo di vetro 30 centimetri che si biforca in due porte separate con una striscia di Teflon formando una T-labirinto. Ogni mezzo è analogo a un braccio di un 2-scelta olfattometro stile consentire al soggetto di prova per scegliere tra due campi odore potenziali.
   1. Saggi per il montaggio e la successiva deve avvenire all'interno di un ambiente a temperatura controllata o camera ambientale.
   2. Mount vetro T-maze olfattometro verticalmente come mostrato in Figura 1 e posizionarlo sotto una lampadina fluorescente 900 lux.
   3. Per la diffusione della luce ottimale, il gruppo deve essere montato all'interno di un 1,0 x 0,6 x 0,6 m contenitore opaco per massimizzare la diffusione uniforme della luce.
   4. Collegare le braccia olfattometro a fonti di odore che saranno alloggiati in fase solida micro-estrazione fonte chamb azienda / odoreer (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville, FL) attraverso teflon, vetro connettori dei tubi. Ogni SPMEC comprende un tubo di vetro diritto (17,5 cm x 3,5 cm) supportata con un ingresso e valvola di scarico per i flussi d'aria in entrata e in uscita (Figura 1).
   5. Collegare il sistema di erogazione di aria ad una sorgente esterna di aria umidificata e carbonio-purificato che è sotto pressione costante (il sistema di erogazione dell'aria ha sia un filtro interno di carbonio per la purificazione dell'aria e di un gorgogliatore per umidificazione dell'aria fonti esterne se non sono disponibili).
   6. Sciogliere campioni chimici desiderati entro appropriato diluente (solvente) e pipetta su un substrato di rilascio lento come uno stoppino di cotone (Petty John Packaging, Inc., Concord, NC). Il trattamento di controllo dovrebbe consistere di uno stoppino di cotone impregnato di solvente solo.
   7. Per prevenire la contaminazione significativa del vetro, avvolgono gli stoppini di cotone trattati e di controllo del tessuto (laboratorio Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) e il luogo nei due bracci SPMEC (ARS, Inc., Gainesville, FL). Nel caso di campioni vegetali vivi, una camera di raccolta volatili ghigliottina può essere attaccato al olfattometro contenente trattamenti in luogo del SPMEC (Figura 1).
   8. Fornire purificata e umidificata attraverso il SPMEC (o camera ghigliottina volatile) tramite due pompe collegate ad un sistema di erogazione di aria (Figura 1). Mantenere la velocità del flusso dell'aria a 0.1 L / min per mezzo di entrambi i rami del olfattometro.
2. Impiegando olfattometro per testare la risposta degli artropodi di repellenti putativi. Nella presente descrizione, un insetto hemipteran, psilla agrumi asiatica, Diaphorina citri, è stato utilizzato come test di artropodi. Risposta è stato testato a volatiles agrumi soli o in combinazione con un (dimetil disolfuro) repellente e aria pulita come fonti di odore.
   1. Condurre tutti gli esperimenti a temperatura e umidità relativa standardizzata.
   2. Prima di tutti i test, esporre test soggetti per pulire l'aria pulita dell'aria in funzione del solvente o aria pulita rispetto al T-labirinto olfattometro per verificare l'assenza di errori di posizionamento o un effetto di solvente sul comportamento del soggetto del test.
   3. Assegnare una fonte di odore casualmente ad uno dei bracci della olfattometro all'inizio di ciascun saggio biologico. Invertire questa posizione dopo ogni 10 soggetti di prova analizzati, come minimo, di eliminare il potenziale di errori di posizione.
   4. Verificare la risposta da un minimo di 30 (e fino a 120) soggetti sottoposti al test per trattamento combinato.
   5. Permette di prova soggetti 100-300 sec esporre una risposta comportamentale sulla base della risposta precedentemente stabilito (latenza) intervallo.
   6. Record se il soggetto entra nel braccio di trattamento, braccio di controllo o rimane nel porto di rilascio o al di sotto della T-labirinto divisione.
   7. Segna un braccio di trattamento o di controllo scelta quando un soggetto di prova attraversa la divisione T-labirinto e si muove in due bracci olfattometro.
   8. Segna un braccio di rilascio scelta quando una prova sonformemente rimane nel porto di rilascio o sotto il T-maze divisione.
   9. Pulire la olfattometro e tubi di collegamento accuratamente con soluzione di sapone 2% e cuocere i componenti di vetro a 200 ° F tra l'uso di trattamenti diversi odori.
   10. Per i saggi in cui sono presentati putativi trattamenti repellenti nel T-labirinto olfattometro con o senza un trattamento chimico contro aria pulita, confrontare il numero di soggetti di prova rimanenti nel punto di rilascio e non entrare olfattometro tra trattamenti da una analisi della varianza ( ANOVA) seguita dal test di Tukey HSD (α <0,05). Nei casi in cui i soggetti del test lasciano il braccio di rilascio, confrontare il numero di scelta del braccio di controllo rispetto al braccio di trattamento con chi quadrato (χ ²⁾ analisi a α <0.05.

Risultati

Attrazione di agrumi asiatici psilla (Diaphorina citri) adulti agli odori dei loro volatili natali di piante ospiti (agrumi) è illustrata nella figura 2A. Adulti significativamente (α <0,05) più scelto il braccio del T-maze olfattometro ricezione odori da piante di agrumi viventi come rispetto ad una forma (aria pulita) di controllo.

Un esempio di repulsione è illustrato nella figura 2B. In questo caso, gli insetti sono stati esposti a un braccio di T-maze volatili agrumi ricezione, mentre il secondo braccio ricevuto volatili da un impianto di agrumi che è stato trattato con il noto repellente, disolfuro di dimetile ^11. In questo caso, tre tipi di comportamenti sono stati osservati. Il numero di psille arrestati al braccio di apertura e non risponde non differiva statisticamente dal numero di entrare nel braccio ricevente gli odori da piante di agrumi solo (figura 2B). Tuttavia, non psille entrato nel braccio contenente tha pianta ospite volatili quando co-presentato con il repellente (Figura 2B).

Figura 1. Diagramma schematico di orientamento verticale T-maze olfattometro unito al sistema di erogazione di aria e odori sblocco trattamento. Lo schema è un adattamento di figura 1 in Mann et al. ^10. Un soggetto in esame viene posto singolarmente nella camera di rilascio del 2-port diviso T-olfattometro. Si muove verso gli odori attraverso una valvola a saracinesca che permette di controllare il movimento verso l'alto nella olfattometro e impedisce l'insetto di eseguire la scansione di nuovo in zona punto di rilascio. Il tubo biforca 10 centimetri dopo il valore cancello. Una risposta positiva a un odore viene registrato una volta l'insetto si muove 0,5 centimetri in una parte specifica della divisione. La camera di raccolta volatili ghigliottina può essere usato al posto di un solido PHAe micro-estrazione azienda / fonte camera di odore (SPMEC) come fonte di odore.

Figura 2. Risposta di agrumi asiatici psilla (Diaphorina citri) adulti di volatili da piante ospiti di agrumi rispetto di controllo aria pulita (A) o volatili agrumi contro volatili agrumi co-rilasciati con un repellente (dimetil disolfuro) (B) in un orientamento verticale T -maze olfattometro Figura 2A:. Solo l'analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test di Tukey HSD (α <0,05) è stata eseguita per confrontare il numero di psilla una scelta tra due bracci (2 trattamenti, n = 120). Colonne indicate da lettere diverse sono significativamente diversi tra loro (α <0,05) Figura 2B:. Unidirezionali analysè di varianza (ANOVA) seguita dal test di Tukey HSD (α <0,05) è stata eseguita per confrontare il numero di psilla fare una scelta fra braccio o rimanente nel punto di rilascio (3 trattamenti, n = 120). Colonne indicate da lettere diverse sono significativamente diversi tra loro (α <0,05).

Discussione

Qui, un dispositivo di saggio e il protocollo sono descritte per misurare la risposta di piccoli artropodi (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) a odoranti. Il metodo prevede un test a scelta, permettendo l'insetto di fare una scelta tra due campi odoranti nel caso di saggi valutazione di un attrattivo putativo. Inoltre, il soggetto prova può visualizzare tre tipi di comportamenti lasciando il braccio di apertura e inserendo uno di due campi potenziali odore, o di rimanere nel braccio di apertura, nel caso di saggi di repellenza. Il olfattometro consente per la raccolta dei dati ad alta velocità in quanto si avvale della geotactic negativo (tendenza a muoversi verso l'alto) e phototactic positivo (tendenza a muoversi verso la luce) naturale risposta comportamentale di molti artropodi. Sebbene la dimostrazione presente esempio utilizza un psyllid prova insetto, il dosaggio può essere facilmente adattato per artropodi in generale, sia quelli che utilizzano volo o camminare come modi predominanti di trasporto.

Olfactometers progettati per misurare la risposta degli insetti sono stati inizialmente sviluppati decenni fa e hanno svolto un ruolo importante nel chiarire attrattivi e repellenti insetti ^12. I disegni specifici di tali olfactometers variare, tuttavia, variazioni sul tema generale della scelta due test qui descritto, così come, simili Y-tube saggi sono stati spesso utilizzati per misurare la risposta artropodi alle sostanze chimiche. Tunnel di volo più grandi che possono causare un volo prolungato di insetti ⁹ sono anche comportato la raccolta di dati innovativi chiarire i meccanismi fondamentali del volo degli insetti e di orientamento per semiochimici, così come, i dati informare utilizzo pratico di strumenti di controllo dei parassiti.

Spesso è necessario per la progettazione su misura di un olfattometro e alla relativa strumentazione per la biologia del soggetto specifico test di artropodi. Tali olfactometers che possono essere utilizzati in un gruppo generale di insetti sono più utili di quelli specific a un piccolo gruppo, ma a volte l'importanza economica di un piccolo gruppo di insetti determina la necessità di sviluppo di un olfattometro molto specifica e tecnica di dosaggio. Il progetto attualmente descritto si basa su tecniche di artropodi in precedenza familiari. Consente una più standard due scelte saggio di Y-tube saggi biologici in cui il sito sperimentale o di prova scelta prende la forma di un dispositivo a forma di Y vetro ^7. Tipicamente, un braccio di un tubo a Y riceverà un odorizzante trattamento, mentre l'altro sarà lasciato vuoto ^13. Variazioni su olfactometers possono comprendere l'aggiunta di più bracci radianti ¹⁴ e anche l'aggiunta di un mezzo di suolo per saggiare il comportamento degli organismi spostano attraverso il suolo ^15. Nello sviluppo di tali olfactometers e saggi associati, è importante considerare come strettamente condizioni naturali vengono replicati e quindi la reale rilevanza delle risposte comportamentali valutati in termini di biologia dei soggetti di prova. Per una lagrado rge, i dati raccolti verranno solo essere così utile come la rilevanza del biotest comportamentale rispetto alla ecologia comportamentale dell'organismo ^16.

Il olfattometro attualmente descritta e biologico comportamentale è specificamente progettato per un insetto hemipteran che tende ad avviare volo come brevi "salta" ^16. L'orientamento verticale del olfattometro e la disposizione sorgente luminosa facilitare l'inizio dell'azione insetti e quindi la successiva chimicamente mediata comportamento orientamento può essere saggiata con efficienza e produttività elevata. Questa disposizione saggio comportamentale può probabilmente essere utilizzato per una vasta gamma di volare o camminare taxa artropodi o potrebbe essere facilmente modificato per adattarsi alla necessità di non-organismi artropodi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome di attrezzature	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Due porte diviso T-olfattometro	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	Nessuno (su misura)	Se non è disponibile da ARS, Southern scientifico (Gainesville, FL) anche attualmente produce e distribuisce tali apparecchiature.
In fase solida micro-estrazione azienda / sorgente camera odore di teflon, vetro connettori dei tubi.	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	RV-R3	Vedi sopra un commento
Air sistema di erogazione	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	HADS-2AFM2C.4	Vedi sopra un commento
Ghigliottina camera	Analitica Researco Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	L3GP3	Vedi sopra un commento