Generación y cuantificación de 3 dimensiones de las lesiones arteriales en ratones mediante tomografía óptica de proyección

Resumen

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Resumen

La generación y el análisis de las lesiones vasculares en modelos animales adecuados es una piedra angular de la investigación de las enfermedades cardiovasculares, la generación de información importante en la patogénesis de la formación de la lesión y la acción de las terapias innovadoras. El uso de ratones propensos aterosclerosis, los métodos quirúrgicos de la inducción de la lesión, y la modificación de la dieta ha mejorado dramáticamente la comprensión de los mecanismos que contribuyen al desarrollo de la enfermedad y la posibilidad de nuevos tratamientos.

Clásicamente, el análisis de las lesiones se realiza ex vivo usando técnicas histológicas 2-dimensionales. Este artículo describe la aplicación de la tomografía de proyección óptica (OPT) para la cuantificación 3-dimensional de las lesiones arteriales. Como esta técnica es no destructivo, que puede ser utilizado como un complemento a los análisis histológicos e inmunohistoquímicos estándar.

Lesiones de la neoíntima fueron inducidos por el alambre de inserción o la ligadura de la técnica femoral ratónery, mientras que las lesiones ateroscleróticas se generaron mediante la administración de una dieta aterogénica a ratones deficientes en ApoE.

Las lesiones fueron examinados utilizando imágenes OPT de la emisión autofluorescente seguido histológico complementaria y análisis inmunohistoquímico. OPT claramente distinguidos lesiones de la pared vascular subyacente. Tamaño de la lesión se calculó en las secciones 2-dimensionales usando planimetría, lo que permite el cálculo de volumen de la lesión y el área de la sección transversal máxima. Los datos generados usando OPT fueron consistentes con las mediciones obtenidas usando histología, confirmando la precisión de la técnica y su potencial como un complemento (en lugar de alternativa) a los métodos tradicionales de análisis.

Este trabajo demuestra el potencial de la OPT para obtener imágenes de las lesiones ateroscleróticas y la neoíntima. Proporciona una rápida, muy necesaria técnica ex vivo para la cuantificación 3-dimensional de rutina de la remodelación vascular.

Introducción

La formación de lesiones arteriales es central a la alta morbilidad y mortalidad asociada con la enfermedad cardiovascular ^1. Formación de la lesión se considera que está causada por una respuesta inflamatoria sin restricciones a lesión arterial ^2. Las lesiones ateroscleróticas forman lentamente en respuesta a una lesión crónica a la pared arterial mientras que las lesiones reestenóticas desarrollan rápidamente después de daños mecánicos aguda (por ejemplo, después de la implantación del stent). Los mecanismos que contribuyen al desarrollo de las lesiones arteriales se han aclarado considerablemente por el uso de modelos animales apropiados, a menudo en combinación con manipulaciones genéticas pertinentes ^1.

Análisis de tamaño de la lesión y la composición ha dependido en gran medida de clásicamente ex vivo, histología 2-dimensional (aunque esto está cambiando con el desarrollo de métodos mejorados para la detección in vivo y ex vivo y análisis de las lesiones en animales pequeños ^{3). El análisis histológico de las lesiones arteriales es un trabajo intensivo, consume tiempo y proporciona información limitada de la estructura 3-dimensional. Por ejemplo, la carga de lesión es comúnmente evaluó midiendo el área de sección transversal de una lesión (ya sea en sitios seleccionados aleatoriamente o en el sitio de máxima oclusión). Esto proporciona un análisis incompleto de la carga global de la lesión. Todo el montaje tecnología de imágenes en 3 dimensiones ofrece una posible solución a este problema, pero se han descrito sorprendentemente pocos enfoques adecuados. Esto puede ser debido predominantemente con el tamaño de las arterias de ratón que son demasiado grandes para un solo fotón microscopía confocal, pero demasiado pequeño para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) y 4 de rayos X de tomografía computarizada (CT) 5. Aplicación de ex vivo MRI y CT micro para el estudio de las lesiones ateroscleróticas en ratones sugiere que ofrecen una resolución limitada, incluso en relativamente grandes arterias. Añadido a esto, los tiempos de adquisición relativamente largos requeridoslimitar el rendimiento (y aumentar los costos de exploración) 4,6.}

Desarrollo de nuevas técnicas de imagen óptica (como la tomografía de coherencia óptica ^3,7 y foto-acústica tomografía ⁸⁾ ofrece mucho potencial para mejorar la imagen de las lesiones en las arterias murinos. Potencial similar se muestra mediante tomografía de proyección óptica (OPT), que fue desarrollado para permitir el análisis de embriones de ratón. OPT se diseñó para especímenes de imágenes que van desde ~ 0,3 a 10 mm de diámetro ^9. Transmisión de imágenes registra la opacidad de una muestra semi-transparente a la luz visible policromática y, se puede utilizar para la identificación de las estructuras anatómicas. Emisión registros de imágenes emisión de luz después de excitación a longitudes de onda específicas de endógena (por ejemplo, colágeno, elastina) y fluoróforos exógenos en la muestra. Esto también puede proporcionar información anatómica (ya que los diferentes componentes del tejido pueden diferir en el tipo y la densidad de las especies autofluorescentespresente). Además, la distribución de la inmunorreactividad o la expresión génica se puede determinar con el uso de sondas fluorescentes apropiados ^10. Para cualquiera de los modos de formación de imágenes (transmisión o emisión), la luz es enfocada a un dispositivo de acoplamiento de carga para permitir la captura de la imagen iterativa a medida que gira la muestra (generalmente 400 imágenes a 0,9 ° incrementos). Estos pueden ser utilizados para el cálculo de volumen por métodos de reconstrucción tomográfica estándar (como retroproyección filtrada (utilizando un algoritmo de cono) o reconstrucción iterativa).

Este video demuestra nuestra nueva aplicación de OPT para el análisis de 3 dimensiones rápida, cuantificable y rentable de las lesiones ateroscleróticas y la neoíntima, tal como se describe anteriormente en Kirkby et al. ^11. La técnica ha demostrado ser adecuado para la cuantificación de tamaño de la lesión en tres modelos comúnmente utilizados: (i) de la arteria femoral de alambre de la lesión; (Ii) ligadura de la arteria femoral, y (iii) la aterosclerosis inducida por la dieta en apolipoprotein E deficiente (apoE ^{- / -)} ratones.

Protocolo

1. Inducción quirúrgica de neointimal Las lesiones en la arteria femoral de ratón

1. Los experimentos con animales se deben realizar de conformidad con los requisitos éticos nacionales e institucionales. Toda cirugía debe realizarse utilizando una técnica aséptica apropiada. La inducción de las lesiones de la neoíntima se logra utilizando una modificación de la técnica descrita por Roque et al. ¹² y Sata et al. ^13.
2. Pesar macho ratones C57BL6 / J (Edad 10-12 semanas; peso 25-30 g), entonces anestesiar mediante la entrega de 4-5% de isoflurano en una cámara de inducción. Una vez que la anestesia ha sido inducida, transferir el ratón para una estera calienta a mantener la temperatura corporal a 37 ° C. Continuar administración de isoflurano (2-3%) a través de una máscara.
3. Una vez que un nivel adecuado de anestesia se ha inducido (falta de respuesta a la pizca dedo del pie), dar cobertura analgésica mediante la administración de buprenorfina (0,1 mg / kg ^-1). A continuación, coloque el ratón en una posición supinad afeitarse la superficie ventral de la extremidad posterior izquierda.
4. Hacer una incisión para exponer los músculos de la extremidad posterior y superior, entre la bifurcación con la arteria poplítea y la pared abdominal, utilice disección roma para aislar la arteria femoral y la vena del nervio femoral. Riegue la herida como lo requiere el uso de un 1% w / v lidocaína.
5. Coloque proximal (cerca de la pared abdominal) y distal (inmediatamente debajo de la rama con la arteria poplítea) ligaduras temporales (6/0 Mersilk) alrededor de la arteria femoral y la vena para controlar el flujo de sangre. Entonces aislar la arteria poplítea (aproximadamente 2-5 mm distal a la rama con la arteria femoral) y ligar distalmente. Coloque una segunda ligadura, no condicionada por debajo de la arteria poplítea.
6. Hacer una pequeña incisión (arteriotomía) en la arteria poplítea, inmediatamente distal a la rama con la arteria femoral, prevención de la hemorragia mediante la aplicación de presión a la ligadura temporal proximal. Avanzar en una recta, surgido 0.014 "cable guía1-1,5 cm a lo largo de la arteria femoral en la dirección de la pared abdominal y dejan en su lugar durante 30 segundos (Figura 1A).
7. Retire el alambre de guía y ligar la arteria poplítea encima de la arteriotomía, utilizando la ligadura colocado para tal fin, y teniendo cuidado de no ocluir la arteria femoral.
   NOTA: Para las lesiones inducidas ligadura. Remodelación neointimal sin lesión intraluminal puede ser inducida por la ligadura de las arterias femorales o poplíteas (Figura 1B y 1C). Para ello siga los pasos 01.01 a 01.05. Sin embargo, no cometa el arteriotomıa pero (evitando el paso 1.6) o bien (i) ligar la arteria poplítea inmediatamente distal a la arteria femoral o (ii) ligar la arteria femoral común en el punto de bifurcación con la arteria poplítea. A continuación, proceder con el paso 1.8.
8. Eliminar ligaduras temporales, cerrar la herida con una sutura externa discontinua (5/0 Mersilk) y aplicar la crema EMLA (2,5% de lidocaína, prilocaína 2,5%). Permitir a los animales para re ganar conciencia (generalmente 5-10 min) y asegúrese de que se están moviendo libremente alrededor de su jaula (leve cojera puede ser evidente en la pierna afectada, pero esto debe resolver en los primeros 2-3 días después de la cirugía) antes de regresar a los locales de alojamiento. Los ratones no tienen que ser alojados por separado después de la cirugía.
9. Permita que los animales se recuperen durante un máximo de 3 meses. Las lesiones pequeñas comenzarán a aparecer ~ 7 días después de la lesión de alambre y alcanzarán un tamaño máximo estable después de ~ 21 a 28 días.

2. Inducción de lesiones ateroscleróticas en la apolipoproteína E ^{- / -} ratones

1. Administrar dieta occidental (colesterol 0,2%; dietas de Investigación, EE.UU.) para machos, 6 semanas de edad ratones ApoE-nulo (criados en casa) durante 12 semanas.
2. Las lesiones ateroscleróticas a menudo son visibles en la inspección macroscópica del arco aórtico y sus ramas principales (Figura 2).

3. Analizar arterial lesiones usando proyección óptica de Positrones (OPT)

nt "> NOTA: imágenes OPT de lesiones en arterias femorales murinos y muestras del arco aórtico se obtuvieron utilizando un tomógrafo óptico de proyección.

1. La eutanasia a los ratones por fijación por perfusión transcardiaca y desangramiento bajo anestesia terminal (80 mg / kg de pentobarbital sódico), usando heparinizada (10 U / ml) solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de 10% de formalina tamponada neutral.
2. Aislar arterias femorales o del arco aórtico y sus ramas principales (la arteria carótida izquierda, la arteria subclavia izquierda, tronco braquiocefálico), según proceda, y eliminar el material peri-adventicia extraña. Post-fix en 10% de formalina tamponada O / N, antes de su almacenamiento en etanol al 70% hasta que se necesite.
3. Arterias Insertar en el 1,5% de agarosa de bajo punto de fusión, pre-filtradas a través de Whatman 113 V papel. Coloque cada muestra a un OPT soporte magnético con adhesivo de cianoacrilato con el eje del vaso en línea con la de la montura. Recorte el exceso de agarosa a una forma cónica. Deshidratar en 100% de metanol durante al menos 12 h.
4. Cvasos Lear de inmersión (para 12-24 hr) en una mezcla de alcohol bencílico y benzoato de bencilo (1: 2 v / v).
5. Coloque las muestras despejadas en un tomógrafo calibrado. Establezca la resolución de 1024 x 1024, y determinar un aumento óptico que permite que todo el área de interés para ser visto. Volumen OPT es isotrópico el eje z se reconstruye a la misma resolución (es decir, 1,024 x 1,024 x 1,024), tamaño del voxel ~ 200 micras. Esto puede representar una estimación sobre de la resolución, ya que es probable que sean artefactos de reconstrucción. Ajuste posición de la muestra de modo que gira sobre su propio eje en el centro del campo de vista en el campo brillante, canal de transmisión.
6. En el canal de emisión filtro GFP1 (filtro de excitación 425 nm con 40 nm de paso de banda; filtro de emisión: 475 nm pase largo), se centran la muestra y ajustar el tiempo de exposición para maximizar el rango dinámico de la imagen resultante (evitar la sobre-saturación). Analiza el buque en sólo el canal de emisión GFP1, con un paso de 0,9 ° de rotación.
7. En conclusión, confirme calidad de adquisición de datos utilizando el software DataViewer. Eliminar espécimen desde el escáner.
8. Para permitir el posterior análisis histológico, el lugar de la muestra en metanol al 100% durante> 24 horas antes de la transformación de la cera de parafina de forma normal.

4. Imagen de Reconstrucción y Análisis

Tomográfica re-construcción por retroproyección filtrada se realiza usando software NRecon o similar. Las reconstrucciones se pueden realizar sin supervisión, en lotes.

1. Mejorar la calidad de imagen mediante la compensación de la desalineación y el ajuste de los niveles de intensidad de la imagen.
2. Compruebe la calidad de la reconstrucción de la imagen utilizando el software DataViewer.
3. Identificar la sección correspondiente de la muestra para el análisis. Mantenga esta longitud coherente entre buques si las dimensiones luminales se registrarán.
4. Definir el contorno de las lesiones trazando manualmente la frontera apropiado para 1 de cada 50 re-construida secciones transversales.
5. Compruebe cada sección transversal intercaladas para asegurar interpolaciones generadas por ordenador son correctas. Ajuste manualmente la frontera en caso necesario.
6. Establecer el umbral de nivel de gris de manera que sólo se selecciona la lesión y exportar los datos de medición.
7. Para cada análisis, definir una región vertical de interés que contiene la lesión y trazar la frontera entre los medios y la neoíntima (es decir., La posición de la lámina elástica interna) por cada 50 ^° de exploración de línea. Interpolar las fronteras de la íntima / media de las líneas de exploración entrelazadas en el software, y verificar y corregir el ajuste cuando sea necesario. Además este segmento definido volumen tridimensional a un umbral de intensidad definido manualmente para producir un conjunto imagen binaria en la que los píxeles blancos representan neoíntima y píxeles negros representan lumen de patentes.
8. Las medidas tomadas son: el volumen total de la lesión (volumen objeto), el volumen luminal (volumen total - volumen objeto) y la distribución de la lesión y la luz cruzada sectaárea ional a lo largo de la longitud axial del recipiente estudiado.

Resultados

Exploración preliminar de las arterias sanas (no lesionados) murinos femorales (n = 5) demostró que la transmisión de imágenes no proporcionó imágenes útiles. Esto fue una consecuencia de las arterias despejadas llegar a ser demasiado transparente (en lugar de demasiado opaco) para imaging.However transmisión, esto es beneficioso para la formación de imágenes de emisión ya que no hay absorbancia / dispersión de la señal emitida. En contraste, las arterias femorales autofluoresce fuertemente en el canal de emisión, con la mayor señal siguiente excitación a 405-445 nm (consistente con un pico de excitación 410 nm para elastina ^14). Rodajas de 2 dimensiones reconstruidas a partir de estas imágenes distinguirse claramente los medios de comunicación desde la luz y la adventicia y luz.

En arterias femorales murinos cosechado 28 días después de Wire- (n = 6) o ligation- (n = 5) engrosamiento neointimal lesión inducida fue evidente en las proyecciones de emisiones no tomográficas (Figura 3A). En reconstruidos 2-Dimensrebanadas ional, las lesiones de la neoíntima concéntricos podían distinguirse de los medios de comunicación por su emisión más débil (Figura 3B y la Figura S1).

Imágenes emisión OPT de muestras enteras de montaje del arco aórtico y sus ramas principales de ratones aterosclerótica (n = 8) lesiones identificadas con la distribución anatómica prevista (es decir., En la curvatura menor del arco aórtico, la arteria innominada, y los orígenes de la carótida izquierda y la arteria subclavia izquierda (Figura 4A). imágenes transversales indicaron que éstos eran típicamente lesiones excéntricas y eran fácilmente distinguibles de los medios de comunicación y lumen (Figura 4B, figuras S2 y S3).

Arterias de procesamiento para el análisis histológico tras OPT confirmaron el carácter no destructivo de OPT, con secciones teñidas con éxito utilizando histológico (Estados Unidos Trichrome, PICRosirius rojo) e inmunohistoquímica (α-SMA, Mac-2) técnicas (Figuras 3C y 4C).

Medición de tamaño de la lesión usando OPT se ha demostrado que ser coherente con las mediciones obtenidas usando análisis de imagen de las secciones histológicas tomadas de la misma arteria ^11.

Mediciones planimétricas del área de la lesión obtenidos por OPT y la histología correlaciona estrechamente por regresión lineal para Wire- (R ² = 0,92) y la inducida por ligación (R ² = 0,89) lesiones neoíntima y placas ateroscleróticas (R ² = 0,85). Un beneficio importante de OPT es su capacidad para permitir el análisis 3-dimensional. Mediante el desarrollo de la cuantificación volumétrica de las lesiones con esta técnica, hemos sido capaces de registrar volúmenes de lesión en la unidad Wireless (0,1100 ± 0,0091 mm ^3; n = 6) y las arterias femorales ligadura lesionados (0,0200 ± 0,0089 mm ^3, n = 5) y también en las arterias braquiocefálica ateroscleróticas (0.180 ± 0,018 mm ^3; n = 8). Las mediciones fueron altamente reproducibles (coeficientes de variación 5,4%, 11,4% y 4,8%, respectivamente, n = 4) para todos los tipos de lesión. Lesiones neointimal en los vasos de alambre heridos fueron mayores (p <0,0001) que los producidos por la ligadura, en consonancia con el mayor grado de daño causado por el primero.

Los datos generados también podría expresarse como perfiles de lesión (Figura 5) y prestados por dinámica, evaluación cualitativa (ver figuras S1 - S3). Este enfoque demostró claramente el alcance de la formación de lesiones en respuesta a diferentes procedimientos de lesiones y destacó la desigual distribución de la formación de lesiones en los vasos lesionados.

Figura 1: Los métodos para iniciar la formación de lesiones en la arteria femoral murino & #.160; (A) de inserción retrógrada de un alambre guía de angioplastia en la arteria femoral, por medio de una arteriotomía en la arteria poplítea estimula la formación de lesiones en respuesta a estirar la lesión y la eliminación del endotelio. El flujo de sangre se restablece sobre la sección lesionada del vaso. (B) la proliferación neointimal en ausencia de intraluminal estiramiento, denudación o interrupción de flujo sanguíneo puede ser inducida por ligando, ya sea la femoral o la arteria poplítea inmediatamente distal a la bifurcación de la arteria femoral. (C) A denudando falta de respuesta más severa lesión / proliferación puede ser inducida por la ligadura de ambas las arterias femoral y poplítea a través del punto de la arteria femoral común rama. Esta técnica también bloquear el flujo sanguíneo en la porción distal de la arteria femoral.

Figura 2:. Deposición Característica de ateroma en el arco aórtico ratón Aterosclerosis propensos (Apolipopotein E ratones deficientes) alimentados con una dieta alta en colesterol occidental durante 12 semanas desarrollan un patrón característico de deposición lesión en el arco aórtico y sus ramas principales. Como se ha demostrado, las lesiones son visibles (flechas), mediante inspección bruto bajo un microscopio de disección, en el arco aórtico, la arteria braquiocefálica, y en el ostium de la arteria carótida izquierda y la arteria subclavia izquierda.

Figura 3:. Formación de la lesión después de la ligadura de la arteria femoral izquierda (A) Imágenes de emisión de fluorescencia para no tomográficas (invertidos para aumentar la claridad - regiones oscuras corresponden a la emisión más fuerte) permitir la identificación de engrosamiento de la íntima (arrowhe rojaanuncios). (B) regiones vasculares diferenciados y el lumen se pueden distinguir en las reconstrucciones tomográficas. (C) El análisis histológico (Estados Unidos tricrómico) hace hincapié en la clara semejanza con imágenes obtenidas mediante OPT. Las barras de escala en (AC) son 200 mm. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹ Las barras de escala en (AC) son 200 micras.

Figura 4:. Imaging de ateroma en el arco aórtico de ratones propensos aterosclerosis (A) ateroma (puntas de flecha roja) es fácilmente evidente en imágenes no tomográficas (invertida de modo que las regiones más oscuras indican la emisión más fuerte, mejorando así la claridad) del arco aórtico, en sitios predicho como ateroma de soporte mediante inspección bajo microscopio de luz (ver Figura 2). (B) Este patrón de distribución se confirma en cr tomográficaoss-secciones. (C) histológico (Estados Unidos tricrómico) tinción muestra gran similitud con las secciones tomográficas, e inmunohistoquímica utilizando varios anticuerpos diferentes enfatiza el carácter complementario de OPT con los enfoques tradicionales de análisis de la lesión. Las barras de escala en (A-B) son 1 mm; Barra de escala en (C) es de 250 micras. RSA, la arteria subclavia derecha; RCA, la arteria carótida derecha; LCA, la arteria carótida izquierda; LSA, arteria subclavia izquierda; BCA, tronco braquiocefálico; AAo, aorta ascendente; Dao aorta descendente. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

Figura 5: Análisis de los perfiles de la lesión y del lumen indica variando grado de proliferación neointimal en respuesta a diferentes métodos de lesión arterial tomografía de proyección óptica permite lesión y lumen cruzar MEDICIÓN seccionales.ts que se representan frente a distancia a lo largo de la arteria femoral. Esto demuestra claramente que, en comparación con una arteria no lesionado (A), la ligadura parcial (B) produce lesiones pequeñas, relativamente discretos, mientras que la ligadura total (C) produce una oclusión completa en el sitio de la ligadura de la lesión pero no se extiende lo largo de la arteria . Lesión intraluminal alambre (D) produce una lesión que ocluye casi completamente la porción distal de la muestra y se extiende a lo largo de toda la longitud de la sección de escaneado de la arteria. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

Figura S1. Reconstrucción animada de imágenes de cortes transversales obtenidos de una arteria femoral de ratón después de la lesión de ligación. Este tipo de imagen animada es útil tanto para el análisis cualitativo y cuantitativo. A medida que la animación se mueve desde el proximal a las secciones distales de la arteria el desarrollo gradual de una neoíntima oclusiva, discoernible desde la luz y los medios de comunicación, es evidente. Ramas laterales pueden ser fácilmente identificados y hay oclusión luminal evidente y remodelación hacia el exterior de la arteria como la lesión aumenta de tamaño. La oclusión completa del vaso se produce una vez que se alcanza el sitio de la ligadura. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

.. Figura S2 reconstrucción animada de imágenes en sección transversal de un arco aórtico de un ratón-aterosclerosis propensos La animación comienza con secciones transversales de la ascendente (a la izquierda - que aparece primero) y descendente (derecha) aorta. Las lesiones pequeñas aparecen en la aorta ascendente como los movimientos de exploración en la dirección del arco aórtico. Las imágenes a continuación, se mueven a través del arco para mostrar la ostia fuertemente lesionado del braquiocefálico (izquierda), carótida izquierda (en el centro) y subclavia izquierda (derecha) arterias. A medida que la exploración se mueve distalmente a lo largo de estas ramas de las lesiones reducen y desaparecen poco a poco, primero en el SUBCarteria Lavian, a continuación, en la carótida y finalmente en la arteria braquiocefálica. Curiosamente, la lesión en los movimientos arteria braquiocefálica en el divisor de flujo como este recipiente se divide en la carótida derecha y las arterias subclavias derecha. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

Figura S3. Animada, imagen volumétrica de un arco aórtico de un ratón-aterosclerosis propensos. Tomografía de proyección óptica permite la generación de imágenes en 3 dimensiones, en este caso la demostración de la distribución de la lesión en el arco aórtico de una apolipoproteína E ratón deficiente. (A) ateroma está presente en los sitios esperados (a través de la arteria braquiocefálica, en la ostia de las arterias carótidas y subclavia izquierda y en la curvatura menor del arco aórtico). (B) La segmentación y la representación de la lesión (en rojo) teniendo secciones transversales destaca la distribución de las placas cuando se superpone a la imagen original.Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

Discusión

Análisis de 3 dimensiones tiene un gran potencial para la sustitución o la adición a las técnicas histológicas de 2 dimensiones que aún sostienen la mayoría de las investigaciones de la formación de lesiones arteriales. Aquí OPT se muestra en las pequeñas arterias murinos (con arterias femorales murinos probablemente representan a los vasos más pequeños que pueden ser analizadas con éxito utilizando esta técnica). Es, sin embargo, también es adecuado para su uso con arterias (lesiones) y de otras especies, incluidos los buques humanos de tamaño pequeño y mediano; nuestro grupo ha utilizado con éxito la técnica para analizar lesiones en aorta de conejo (Bezuidenhout et al;. inédito). OPT promete un análisis más rápido y una mayor información estructural en comparación con la histología tradicional y tiene la ventaja de no impedir el posterior análisis de la muestra usando técnicas tanto histológicos e inmunohistoquímicos.

Las imágenes producidas usando OPT dieron detalles anatómicos, mostrando los sitios de formación de la lesióny el tamaño de las lesiones en estas áreas. Las arterias utilizados en estas investigaciones son probablemente cerca del límite de la resolución para la técnica y por lo tanto la calidad de imagen se deteriora hasta un cierto grado por artefactos (probablemente resultan de la desalineación de rotación, compensación incompleta, reflexión / refracción en los vértices de agarosa y problemas de enfoque) . A pesar de esto, los detalles requeridos (es decir, las capas de la pared del vaso) siguen siendo discernible y, por tanto, la técnica es muy útil para la cuantificación de las capas individuales. De hecho, las imágenes podrían ser cuantificados rápidamente y reproducible para proporcionar mediciones de la lesión y el volumen luminal en las secciones de placa de cojinete del buque, así como áreas de sección transversal de la lesión y del lumen en sitios seleccionados en la muestra. Grande (aorta) y medianas (femoral, carótida, subclavia) arterias murinos - los utilizados generalmente para el análisis de la formación de la lesión aterosclerótica y neotintimal en ratones - eran con éxitoanalizó utilizando este método. De hecho ahora hemos utilizado OPT para demostrar el efecto de las intervenciones farmacológicas y manipulación genética en el tamaño de la lesión aterosclerótica y neointimal. Por ejemplo, el bloqueo del receptor de endotelina altera la formación de lesión neoíntima mientras que la supresión selectiva del receptor de la endotelina B desde el endotelio vascular no lo hizo ^15. En la aterosclerosis ratones propensos, la eliminación genética de las enzimas 11β-HSD1 ¹⁶ o galectina 3 ¹⁷ fueron mostrados para reducir el tamaño de las lesiones ateroscleróticas.

Cuantificación del volumen de la lesión es un beneficio obvio de OPT. Se da una indicación más informativo de la carga total de la lesión en una arteria ⁴ que normalmente se obtiene con los métodos histológicos. El análisis de toda la lesión reduce el sesgo de selección y error que inevitablemente se producen cuando las secciones discretas de un recipiente se eligen para su análisis. Producción de perfiles longitudinales de lesión es una fortaleza adicional del OPT, Enfatizado por la comparación de las lesiones inducidas por diferentes tipos de lesiones ^13,16 (Figura 5). Por ejemplo, tanto la ligadura completa y el alambre de inserción de indujeron oclusión casi total cerca de la bifurcación-femero poplítea. Lesión de alambre, las lesiones sin embargo, producidos que se extendían a lo largo de toda la longitud de la sección de escaneado, mientras que las lesiones inducidas por la ligadura arterial disminuyeron rápidamente en tamaño y desaparecen. Este patrón es consistente con la mayor extensión de la lesión causada por la inserción de la guía de angioplastia. Generación de resultados similares utilizando secciones histológicas es caro, que consume tiempo y mano de obra intensiva.

Las ventajas de OPT incluyen la calidad de las imágenes que produce y su velocidad relativa y la simplicidad (hemos escaneado rutinariamente 20 vasos por día). La calidad de imagen parece superior, o al menos comparable, a otros métodos para la generación de imágenes 3-dimensionales ex vivo (tales como MRI y CT micro), yet OPT requiere tiempos de análisis más cortos (tiempo de integración para nuestros estudios era típicamente 1-2sec / imagen) y es menos costoso. Preparación de la muestra se extiende sobre varios días, pero requiere poca mano de obra, los vasos se pueden preparar en lotes, y los datos pueden ser adquiridos en una sesión. En consecuencia, el rendimiento es alto y no requiere el uso extendido del escáner. Es importante destacar que la naturaleza no destructiva de OPT significa que puede ser usado para identificar sitios de interés para el examen inmunohistoquímico; reduciendo así la cantidad de corte y tinción requerido. Es posible que el desarrollo de la ecografía de alta resolución proporcionará un método alternativo para la cuantificación volumétrica de las lesiones en las arterias de este tamaño, pero los autores no son conscientes de todas las publicaciones que demuestran esta aplicación.

Tal como era de esperar, la calidad de imagen en el territorio palestino ocupado es inferior a técnicas microscópicas (que pueden, por supuesto, sólo pueden realizar en muestras más pequeñas). Mejoras propuestas para reconstrucción de los datos podrá dirigirse a esta limitación al permitir futura mejora de la calidad de imagen ^19,20. Otra preocupación metodológica es que el procesamiento de tejido altera características de la muestra. Por ejemplo, la naturaleza lipofílica de la cámara de compensación, es probable que eliminar los lípidos de las lesiones ateroscleróticas, mientras que la deshidratación antes puede causar la contracción (aunque, por supuesto, etapas de deshidratación y de eliminación de lípidos son también una característica de alcohol bencílico / benzoato de bencilo (BABB), la preparación de muestras para incrustar en cera de parafina). BABB se utilizó en esta investigación ya que, en comparación con los agentes de compensación hidrófilos (por ejemplo, glicerol ²¹⁾ hace que sólo pequeños cambios en la morfología.

Hay varias posibilidades para un mayor desarrollo y refinamiento de OPT, particularmente con respecto al seguimiento de la disposición de 3 dimensiones de las células clave y factores que intervienen en la remodelación arterial señalización. La fuerte autofluorescencia del tejido arterial, que es taln ventaja en la generación de imágenes anatómicas, nunca se apaga por métodos existentes de blanqueo ²² y puede restringir el uso de sondas fluorescentes para evaluar los patrones de ARN y distribución de proteínas. El uso de sondas colorimétricas (por ejemplo, β-galactosidasa) visualizado por imágenes de transmisión puede superar esta limitación.

Para concluir, OPT tiene un gran potencial para la formación de imágenes en 3 dimensiones de las lesiones en la íntima de las arterias murinos. Representa un avance considerable en los métodos de 2 dimensiones que son generalmente mucho trabajo y no representan efectivamente el volumen total de la lesión. OPT es relativamente rápido, conveniente y no destructivo. Nuevos desarrollos en el análisis de imágenes prometen aumentar aún más el poder y la utilidad de la técnica.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating Microscope	Zeiss, Germany		OPMI Pico i
Anesthetic Machine	Vet Tech, UK
Fluovac	Harvard Apparatus UK	340387
Fluosorber	Harvard Apparatus UK	340415
Bead Sterilizer	Fine Science Tools, UK	1800-45
Heated Mat	Fine Sceince Tools, UK	21061-10
Balance	Mettler Toledo	MS1602S	PB1502 or equivalent
Sutures	Ethicon, UK		5/0 Mersilk
Guidewire	Cook Inc, USA	C-PMS-251	0.014”
Suture Silk	Fine Science Tools, UK	18020-60	6/0 Mersilk
Surgical Tools	Fine Science Tools, UK	14058-09	Toughcut Iris scissors
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, UK	15000-01
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools, UK	11251-35
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools, UK	11370-31
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools, UK	13008-12
Bulldog clips	Fine Science Tools, UK	18050-35
Bioptonics 3001 Tomograph	Bioptonics, UK
Magnetic OPT Mount	Bioptonics, UK
Computer	Dell Inc, UK
Peristaltic pump	Gilson	F117606	Minipuls 3
DataViewer software	Skyscan, Belgium	v.1.4.4
NRecon software	Skyscan, Belgium	v.1.6.8
CTan software	Skyscan, Belgium	v.1.12
Isoflurane	Merial Animal Health Ltd, UK	AP/Drugs/220/96	100% Inhalation vapor, liquid
Medical Oxygen	BOC Medical, UK	UN1072
Vetergesic	Alstoe Animal Health Ltd, UK		0.3 mg/ml
1% Lignocaine	Hamlen Pharmaceuticals, UK	LD1010	10 ml ampoule
EMLA Cream	Astra Zeneca, UK
Sodium Pentobarbital	Ceva Animal Health Ltd, UK
Western Diet	Research Diets, USA	D12079B	0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline	Sigma UK	P4417
Heparin (Mucous)	Leo Laboratories, UK	PL0043/003GR	250,000 Units
Neutral Buffered Formalin	Sigma, UK	HT501128	10%
Ethanol	VWR BDH Prolabo, UK	20821.33	Absolute AnalaR
Agarose	Invitrogen, UK	16020050	Low melting point
Filter Paper	GE Healthcare, UK	113v	Whatman
Cyanoacrylate adhesive	Henkel, UK	4304	Loctite
Benzyl alcohol	Sigma, UK	B6630
Benzyl benzoate	Sigma, UK	402834
Methanol	VWR BDH Prolabo, UK	20856.296	100%