Un método rápido y eficiente para evaluar la patogenicidad de Ustilago maydis en las líneas de maíz y teosinte

Resumen

Se describe el uso de un método de inyección con aguja para inocular plantas de maíz y teosinto con el patógeno biotrófico Ustilago maydis. El método de inoculación por inyección de agujas facilita la entrega controlada del patógeno fúngico entre las hojas de la planta donde el patógeno entra en la planta a través de la formación de appresoria. Este método es altamente eficiente, permitiendo inoculaciones reproducibles con U. maydis.

Resumen

El maíz es uno de los principales cultivos de cereales en todo el mundo. Sin embargo, la susceptibilidad a patógenos biotróficos es la principal limitación para aumentar la productividad. U. maydis es un patógeno fúngico biotrófico y el agente causal del smut de maíz en el maíz. Esta enfermedad es responsable de pérdidas significativas de rendimiento de aproximadamente $ 1.000 millones anuales en los EE. UU. 1 Varios métodos, incluida la^rotación de cultivos, la aplicación de fungicidas y los tratamientos de semillas, se utilizan actualmente para controlar el smut de maíz². Sin embargo, la resistencia del huésped es el único método práctico para el manejo de la muda de maíz. La identificación de plantas de cultivo como el maíz, el trigo y el arroz que son resistentes a diversos patógenos biotróficos ha disminuido significativamente las pérdidas de rendimiento anualmente^3-5. Por lo tanto, el uso de un método de inoculación de patógenos que entregue de manera eficiente y reproducible el patógeno entre las hojas de la planta, facilitaría la rápida identificación de líneas de maíz que son resistentes a U. maydis. Como un primer paso hacia la identificación de las líneas de maíz que son resistentes a U. maydis,se utilizó un método de inoculación por inyección de agujas y un método de detección de reacción de resistencia para inocular líneas de introgresión de maíz, teosinte y maíz x teosinte con una cepa de U. maydis y para seleccionar plantas resistentes.

Las líneas de introgresión de maíz, teosinte y maíz x teosinte, que constan de unas 700 plantas, fueron plantadas, inoculadas con una cepa de U. maydis,y examinadas para detectar resistencia. Los métodos de inoculación y cribado identificaron con éxito tres líneas de teosinte resistentes a U. maydis. Aquí se presenta un protocolo detallado de cribado de inoculación por inyección de aguja y reacción de resistencia para las líneas de introgresión de maíz, teosinte y teosinte de maíz x teosinte. Este estudio demuestra que la inoculación por inyección de agujas es una herramienta invaluable en la agricultura que puede entregar eficientemente U. maydis entre las hojas de las plantas y ha proporcionado líneas de plantas que son resistentes a U. maydis que ahora se pueden combinar y probar en programas de mejoramiento para mejorar la resistencia a las enfermedades.

Introducción

Las enfermedades fúngicas de las plantas representan una de las amenazas más eminentes para la agricultura. La necesidad de desarrollar cultivos con mayor resistencia a las enfermedades está aumentando debido a las necesidades alimentarias de una creciente población mundial. Los patógenos de las plantas infectan naturalmente a las plantas de cultivo en el campo causando enfermedades que afectan negativamente el rendimiento de los cultivos⁶. Se ha demostrado que la identificación y utilización de plantas resistentes puede mejorar la resistencia y disminuir la pérdida de rendimiento. Se han identificado cultivares resistentes en muchas especies de plantas, incluyendo maíz, trigo, arroz y sorgo inoculando las plantas con un patógeno vegetal y seleccionando líneas resistentes⁷. Por lo tanto, el desarrollo y el uso de un método de inoculación eficiente permitiría que muchas plantas fueran inoculadas y examinadas para detectar resistencia. Se han utilizado varios métodos de inoculación, incluyendo la inoculación por inmersión, el pipeteo del cultivo en suspensión celular del patógeno en el torbellino de la planta y la inoculación por inyección de^{agujas 8-11.} Con cada método, el patógeno debe introducirse de forma fiable entre las hojas de la planta donde el patógeno entra en la planta a través de la formación de appresoria para asegurar el desarrollo del patógeno y la infección de la planta^12,13.

El método de inoculación por inmersión consiste en sumergir una plántula de planta en un cultivo de suspensión de células patógenas, mientras que el método de pipeteo requiere colocar el cultivo de suspensión celular de patógenos en el torbellino de la plántula de plantas. Sin embargo, hay problemas con ambos métodos. En primer lugar, ambos métodos dependen del movimiento natural del patógeno desde la superficie de la hoja hacia el tejido vegetal, que es muy variable. La mayoría de los patógenos entran naturalmente en la planta a través de aberturas estomáticas o heridas en la superficie de la hoja de la planta. Sin embargo, hay variabilidad significativa en la capacidad de los patógenos para penetrar la superficie de la hoja de la planta a través de los estomas y / o heridas en la superficie de la hoja. Por lo tanto, la penetración del patógeno no se puede controlar con cualquier método de la inoculación que puede dar por resultado datos incoherentes. En segundo lugar, cuando se revisa un gran número de plantas, sumergir las plántulas en un cultivo de suspensión de células patógenas puede llevar mucho tiempo y puede limitar el número de plantas que se pueden examinar. Por el contrario, el protocolo de inoculación por inyección de agujas aquí descrito entrega el cultivo en suspensión celular de patógenos entre las hojas de la planta facilitando la formación de appressoria^14. El patógeno entonces utiliza el appressoria recientemente desarrollado para entrar en la planta eliminando el problema de la penetración del patógeno. Además, el protocolo de inoculación por inyección de agujas proporciona una gama de fenotipos para plantas de maíz y teosinto que han sido inoculadas con U. maydis y demuestran una buena infección. Los fenotipos se pueden utilizar como marcador para determinar la mejor concentración para el cultivo de la suspensión de la célula del patógeno dando por resultado fenotipos constantes de la planta dentro y entre diversos experimentos.

Después de la inoculación de la planta con un cultivo de suspensión celular de patógenos, las plantas son típicamente examinadas para detectar un fenotipo resistente o susceptible^8-11,15. Mientras que las escalas de calificación de enfermedades se han utilizado ampliamente para examinar y clasificar los fenotipos de las plantas, las escalas de calificación difieren dependiendo del patógeno que se está analizando. Por lo tanto, un establecimiento de protocolo de escala de calificación de enfermedades para las interacciones de U. maydis y maíz puede ser utilizado para patógenos fúngicos similares¹⁶.

La presente serie de protocolos detalla la inoculación por inyección de agujas con un cultivo de suspensión celular U. maydis y un cribado de reacción de resistencia a enfermedades de las líneas de introgresión de maíz, teosinte y maíz x teosinte. Los protocolos actuales no se limitan a la inoculación por inyección con aguja de U. maydis en plantas de maíz, sino que se pueden utilizar para relativamente cualquier patógeno fúngico y especie de planta. Por lo tanto, incluir los detalles de ambos métodos en el mismo protocolo permitirá a los investigadores utilizar directamente los protocolos para la inoculación y el cribado o manipular los protocolos originales para adaptarse mejor al patógeno y a las especies vegetales de interés.

Protocolo

1. Crecimiento de material vegetal

1. Seleccione las líneas de la planta para la inoculación y la investigación. Para este trabajo se utilizaron dos líneas de maíz, cinco líneas de teosinte y cuarenta líneas de maíz x teosinte con resistencia no caracterizada a U. maydis (Tabla 1).
2. Planta semillas para experimentos experimentales (inyecciónde U. maydis) y de control (inyección de agua) de inyección de agujas. Haga esto para cada línea de planta.
3. Plantar cuatro semillas (réplicas) para cada línea de planta en pequeños pisos empujando las semillas alrededor de 1/2 pulgada en el suelo con el dedo y cubriendo con el suelo ligeramente (Figuras 1A y 1B). No empaque el suelo sobre la semilla. Plantar la semilla más profundamente o empacar el suelo sobre la semilla puede causar problemas con la aparición de plántulas.
4. Riegar las semillas en el suelo. Asegúrese de que el suelo esté empapado y las semillas permanezcan debajo del suelo después del riego.
5. Después del riego, coloque las plantas en una cámara de crecimiento con ambientes diurnos y nocturnos de 28/20 °C de temperatura y 14/10 horas de fotoperiodo, respectivamente y aproximadamente 500 μmol/m² seg   de radiaciones fotosintéticamente activas en la parte superior del dosel. Mantener la humedad relativa durante el día y la noche en aproximadamente el 70% y el 90%, respectivamente.
6. Mantenga todas las plantas en la misma cámara de crecimiento para mantener un entorno de crecimiento que sea congruente en todo el experimento.
7. Después de 10 días, retire las plantas de la cámara de crecimiento e inoculte las plantas con el cultivo de suspensión celular U. maydis utilizando un método de inoculación por inyección de agujas. Nota: Las plantas de maíz se pueden inocular 7 días después de la siembra^8-10. Sin embargo, las plantas de teosinte son demasiado pequeñas después de 7 días. Por lo tanto, inocular tanto las plantas de maíz como las de teosinte 10 días después de la siembra para mantener la consistencia dentro del experimento (ver paso 2.12).

2. Inoculación por inyección de agujas

1. Haga todo el trabajo en una campana de flujo laminar. Retire las existencias de Glicerol de U. maydis del almacenamiento del congelador. Use un asa estéril y cepas de glicerol de raya de las cepas de tipo salvaje U. maydis 1/2 (tipo de apareamiento a1b1) y 2/9 (tipo de apareamiento a2b2, cerca de isogénico a 1/2) en placas de agar dextrosa de papa (PDA). Mantenga las cepas por separado.
2. Coloque las placas de PDA rayadas con U. maydis en una incubadora de 30 °C durante dos días. Si utiliza un patógeno biotrófico diferente, utilice la cepa adecuada, medios y condiciones de crecimiento. Supervise el crecimiento del patógeno durante el período de dos días para asegurarse de que la cepa U. maydis está creciendo bien.
3. Retire las placas de PDA de la incubadora después de dos días. Las placas deben tener un buen crecimiento de patógenos y contener colonias individuales (Figura 2A). Es importante obtener colonias individuales. Si las solas colonias no están presentes restreak las placas en una concentración más baja.
4. Haga todo el trabajo en una campana de flujo laminar. Utilice un palillo de dientes estéril para seleccionar una sola colonia para cada cepa de las placas de PDA. Coloque el palillo de dientes que contiene una sola colonia en un caldo de dextrosa de patata (PDB) de 3 ml. Se aconseja tener 2-3 culturas.
5. Coloque los cultivos de PDB de 3 ml en una incubadora/coctelera de 30 °C durante dos días a 200 rpm. Monitorear el crecimiento de la cultura durante el período de dos días para asegurar el crecimiento de la cultura. La cultura debe aparecer muy nublada.
6. Retire los cultivos líquidos de la incubadora/agitadora y mida la concentración a₆₀₀ OD para asegurarse de que las células se cultivaron a un OD de 1,0 (~ 1 x 10⁷ células / ml)¹⁷.
7. Llevar los cultivos en suspensión celular de U. maydis a una concentración final de 1 x 10⁶ células/ml, utilizando agua en un volumen de cultivo final de 30 ml. Esta concentración resulta consistentemente en una buena infección de las plantas con el cultivo de suspensión celular de patógenos. ^17.

Nota: Se deben ensayar diversas concentraciones de suspensión celular cuando se utilizan diferentes cepas de patógenos para determinar el título celular apropiado necesario para la inoculación^18,19. La concentración final dada para el cultivo de suspensión celular se puede utilizar como punto de partida para el tittering. La concentración adecuada del cultivo en suspensión celular del patógeno debe verificarse visualizando los fenotipos vegetales con buena infección (Figuras 3A-E).

8. Mezcle volúmenes iguales de las dos cepas de U. maydis antes de la inoculación. Si utiliza una cepa patógena, proceda al paso 2.9. Prepare cultivos frescos de suspensión celular de U. maydis para cada experimento de inoculación y deseche los cultivos de suspensión celular después de dos días.
9. Para la inoculación experimental de inyección con aguja, llene una jeringa de 3 ml con el cultivo de suspensión celular U. maydis dibujando el cultivo de suspensión celular en la jeringa.
10. Para la inoculación de inyección de aguja de control, llene una jeringa de 3 ml con agua¹⁷. Utilice el mismo procedimiento para la inoculación experimental de inyección con aguja.
11. Coloque una aguja hipodérmica de 0,457 mm x 1,3 cm al final de cada jeringa de 3 ml. El tamaño de aguja seleccionado entregará el cultivo de suspensión celular entre las hojas de la planta con un daño mínimo al tejido de la planta.
12. Retirar las plantas experimentales y control de la cámara de crecimiento 10 días después de la siembra en preparación para inoculaciones por inyección de agujas (Figura 2B) (ver paso 1.7).
13. Inserte cuidadosamente la aguja hipodérmica que contiene el cultivo de suspensión celular U. maydis en el tallo de una planta experimental en un ángulo de 90° justo por encima de la línea del suelo. Inserte la aguja hasta que esté en el centro del tallo. No empuje la aguja a través del tallo (Figura 2C).
14. Inyectar la planta experimental con unos 100 μl del cultivo en suspensión celular U. maydis ^18,19. Esto variará ligeramente dependiendo de la altura de la plántula. El cultivo de suspensión celular empujará a través del tallo y se moverá en el torbellino de la planta. El cultivo en suspensión celular será visible en el torbellino de la planta. Continúe inyectando 100 μl del cultivo en suspensión celular en cada planta individual hasta que la jeringa de 3 ml esté vacía.
15. Después de la inyección, retire cuidadosamente la aguja del tallo de la planta. Retire la aguja de la jeringa de 3 ml ahora vacía y llénese con agua. Vuelva a colocar la aguja en la jeringa y empuje el agua a través de la aguja para extraer cualquier tejido vegetal que pueda quedar atrapado en la punta de la aguja.
16. Repita los pasos 2.9-2.15 para cada planta experimental. Siga el mismo protocolo para las plantas de control inyectando agua.
17. Coloque las plantas experimentales y de control inoculadas de nuevo en la cámara de crecimiento. Riegar las plantas diariamente humedecer el suelo no el tejido vegetal.
18. Revise las plantas diariamente para detectar el desarrollo de patógenos y reacciones de resistencia de las plantas.

3. Detección de reacción de resistencia

1. Puntuar y registrar las reacciones de resistencia para cada planta 7, 10, 14 y 21 días después de la inoculación (dpi) utilizando una escala de clasificación de reacción de resistencia de 1 a 5. La gravedad de la enfermedad aumenta a medida que aumentan los valores numéricos en la escala de calificación (Tabla 2). Una reacción de resistencia 1C (clorosis de hojas), 1A (producción de antocianinas de hojas) o 2 (agallas de hojas pequeñas) indica resistencia. Una reacción de resistencia de 3 (agallas del tallo), 4 (agalla basal) o 5 (muerte de la planta) indica susceptibilidad (Figuras 3A-E y Tabla 2)^18,19.
2. Puntuar tanto las plantas experimentales como las de control y registrar las calificaciones de reacción de resistencia.
3. Comparar las reacciones de resistencia de las plantas experimentales y de control. Seleccione plantas experimentales con una clasificación de reacción de resistencia de 1C, 1A o 2. Estas plantas se consideran resistentes a U. maydis^18,19.
4. Repita todo el experimento para verificar los fenotipos de la planta.

Resultados

Una inoculación exitosa de inyección de agujas se puede determinar visualizando el fenotipo de las plantas inoculadas con U. maydis (experimental). La mayoría de las plantas experimentales eran susceptibles a la infección por U. maydis. Las plantas susceptibles mostraron un desarrollo de enfermedad muy grave demostrado por la formación de tallo y agalla basal con teliosporas negras(Figuras 3D y 3E, Tabla 2). Varias plantas murieron después de la i...

Discusión

En este estudio, el método de inoculación por inyección de aguja utilizado para entregar una cepa de U. maydis en el tallo de 700 plantas de maíz y teosinte tuvo éxito. Además, se utilizó una escala de clasificación de resistencia a enfermedades revisada para examinar las plantas y detectar el desarrollo de patógenos. Como resultado del uso de ambos métodos, se identificaron líneas de plantas que son resistentes a U. maydis entre 700 plantas de maíz y teosinte que ahora se pueden combinar y ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321