Um método rápido e eficiente para avaliar a patogenicidade dos maydis ustilago nas linhas de milho e teosinte

Resumo

Descreve-se o uso de um método de injeção de agulha para inocular plantas de milho e teosinto com o pato patogênico biotrófico Ustilago maydis. O método de inoculação da injeção de agulha facilita a entrega controlada do patógeno fúngico entre as folhas da planta onde o patógeno entra na planta através da formação de appresoria. Este método é altamente eficiente, permitindo inoculações reprodutíveis com u. maydis.

Resumo

O milho é uma grande cultura de cereais em todo o mundo. No entanto, a suscetibilidade aos pat pato patógenos biotróficos é a principal restrição ao aumento da produtividade. U. maydis é um patógeno fúngico biotrófico e o agente causal do milho smut no milho. Esta doença é responsável por perdas significativas de rendimento de aproximadamente US $ 1,0 bilhão anualmente nos EUA¹ Vários métodos, incluindo rotação de culturas, aplicação de fungicida e tratamentos de sementes são atualmente usados para controlar o smut de milho². No entanto, a resistência do hospedeiro é o único método prático para gerenciar o smut do milho. A identificação de plantas agrícolas, incluindo milho, trigo e arroz resistentes a vários patógenos biotróficos, diminuiu significativamente as perdas de rendimento anualmente^3-5. Portanto, o uso de um método de inoculação de patógenos que fornece de forma eficiente e reprodutivelmente o patógeno entre as folhas da planta, facilitaria a identificação rápida de linhas de milho resistentes aos U. maydis. Como, um primeiro passo para a indentificação das linhas de milho resistentes aos U. maydis,um método de inoculação de injeção de agulha e um método de triagem de reação de resistência foi utilizado para inocular as linhas de introgressão de milho, teosinte e milho x teosinto com uma cepa de maydis U. maydis e para selecionar plantas resistentes.

Foram plantadas linhas de introgressão de milho, teosinte e de milho x teosinto, compostas por cerca de 700 plantas, inoculadas com uma cepa de U. maydis,e rastreadas para resistência. Os métodos de inoculação e triagem identificaram com sucesso três linhas de teosinto resistentes aos u. maydis. Aqui é apresentado um protocolo detalhado de inoculação de injeção de agulha e retração de resistência para linhas de introgressão de milho, teosinto e milho x teosinto. Este estudo demonstra que a inoculação de injeção de agulha é uma ferramenta inestimável na agricultura que pode fornecer maydis entre as folhas da planta e forneceu linhas vegetais resistentes aos maydis u. que agora podem ser combinados e testados em programas de reprodução para melhor resistência à doença.

Introdução

As doenças fúngicas das plantas representam uma das ameaças mais eminentes à agricultura. A necessidade de desenvolver culturas com maior resistência à doença está aumentando devido às necessidades alimentares de uma população mundial em crescimento. Patógenos vegetais infectam naturalmente plantas agrícolas no campo causando doenças que impactam negativamente o rendimento da cultura⁶. Foi demonstrado que identificar e utilizar plantas resistentes pode melhorar a resistência e diminuir a perda de rendimento. Cultivares resistentes foram identificadas em muitas espécies vegetais, incluindo milho, trigo, arroz e sorgo, inoculando as plantas com um patógeno vegetal e selecionando para linhas resistentes⁷. Portanto, o desenvolvimento e o uso de um método de inoculação eficiente permitiriam que muitas plantas fossem inoculadas e rastreadas para resistência. Vários métodos de inoculação têm sido utilizados, incluindo a inoculação de mergulho, a pipetação da cultura de suspensão celular do patógeno no giro da planta e a inoculação da injeção de agulha^8-11. A cada método, o patógeno deve ser introduzido de forma confiável entre as folhas vegetais onde o patógeno entra na planta através da formação de appresoria para garantir o desenvolvimento do patógeno e a infecção vegetal^12,13.

O método de inoculação de mergulho envolve submergir uma muda de planta em uma cultura de suspensão de células patógenas, enquanto o método de pipetação requer colocar a cultura de suspensão de células patógenas no turbilhão da muda vegetal. No entanto, há problemas com ambos os métodos. Em primeiro lugar, ambos os métodos dependem do movimento natural do patógeno da superfície da folha para o tecido vegetal, que é altamente variável. A maioria dos patógenos entra naturalmente na planta através de aberturas estomatais ou feridas na superfície da folha vegetal. No entanto, há uma variabilidade significativa na capacidade dos patógenos de penetrar a superfície da folha vegetal através da estomata e/ou feridas na superfície da folha. Portanto, a penetração do patógeno não pode ser controlada com qualquer método de inoculação potencialmente resultando em dados inconsistentes. Em segundo lugar, ao selecionar um grande número de plantas, submergir as mudas em uma cultura de suspensão celular patógena pode ser demorado e pode limitar o número de plantas que podem ser rastreadas. Por outro lado, o protocolo de inoculação de injeção de agulha descrito aqui fornece a cultura de suspensão de células patógenas entre as folhas da planta facilitando a formação de appressoria¹⁴. O patógeno então utiliza a appressoria recém-desenvolvida para entrar na planta eliminando o problema de penetração do patógeno. Além disso, o protocolo de inoculação de injeção de agulha fornece uma gama de fenótipos para plantas de milho e teosinto que foram inoculadas com U. maydis e demonstram boa infecção. Os fenótipos podem ser usados como marcador para determinar a melhor concentração para a cultura de suspensão celular patógena, resultando em fenótipos vegetais consistentes dentro e entre diferentes experimentos.

Seguindo a inoculação vegetal com uma cultura de suspensão de células patógenas, as plantas são tipicamente rastreadas para detectar um fenótipo resistente ou suscetível^8-11,15. Embora as escalas de classificação da doença tenham sido usadas extensivamente para triagem e classificação de fenótipos vegetais, as escalas de classificação diferem dependendo do patógeno que está sendo analisado. Portanto, um estabelecimento de protocolo de escala de classificação de doenças para as interações de u. maydis e milho pode ser utilizado para patógenos fúngicos semelhantes¹⁶.

A presente série de protocolos detalha a inoculação da injeção de agulha com uma cultura de suspensão celular dos EUA e triagem de reação de resistência à doença de linhas de introgressão de milho, teosinte e milho x teosinto. Os protocolos atuais não se limitam à inoculação de injeção de agulha de U. maydis em plantas de milho, mas podem ser utilizados para relativamente qualquer patógeno fúngico e espécies vegetais. Portanto, incluir os detalhes de ambos os métodos no mesmo protocolo permitirá que os pesquisadores utilizem diretamente os protocolos de inoculação e triagem ou manipulem os protocolos originais para melhor se adequarem ao patógeno e às espécies de interesse vegetal.

Protocolo

1. Crescimento do Material Vegetal

1. Selecione linhas de plantas para inoculação e triagem. Foram utilizadas duas linhas de milho, cinco linhas de teosinto e quarenta linhas de milho x teosintocom resistência não caracterizada aos maydis u.
2. Sementes de plantas para experimentos experimentais (injeçãode maydis) e controle (injeção de água) inoculação de agulha. Faça isso por cada linha de plantas.
3. Plante quatro sementes (replica) para cada linha vegetal em pequenos apartamentos empurrando as sementes cerca de 1/2 polegada para o solo com o dedo e cobrindo levemente com o solo(Figuras 1A e 1B). Não embale o solo sobre a semente. Plantar a semente mais profundamente ou embalar o solo sobre a muda pode causar problemas com o surgimento de mudas.
4. Rege as sementes no solo. Certifique-se de que o solo está encharcado e as sementes permanecem sob o solo após a rega.
5. Após a rega, coloque as plantas em uma câmara de crescimento com ambientes diurnos e noturnos de temperatura de 28/20 °C e 14/10 horas de fotoperíodo, respectivamente e aproximadamente 500 μmol/m² seg   de radiaçãos fotossintéticas ativas no topo do dossel. Manter a umidade relativa durante o dia e a noite em aproximadamente 70% e 90%, respectivamente.
6. Mantenha todas as plantas na mesma câmara de crescimento para manter um ambiente de crescimento que seja congruente durante todo o experimento.
7. Após 10 dias, remova as plantas da câmara de crescimento e inocula as plantas com a cultura de suspensão celular dos EUA por meio de um método de inoculação de injeção de agulha. Nota: As plantas de milho podem ser vacinadas 7 dias após o plantio^8-10. No entanto, as plantas de teosinte são muito pequenas depois de 7 dias. Portanto, inocular as plantas de milho e teosinto 10 dias após o plantio para consistência dentro do experimento (ver passo 2.12).

2. Inoculação de injeção de agulha

1. Faça todo o trabalho em um capô de fluxo laminar. Remova os estoques de glicerol U. maydis do armazenamento do congelador. Use um laço estéril e estrias de glicerol de cepas de u. maydis tipo selvagem 1/2 (tipo acasalamento a1b1) e 2/9 (tipo acasalamento a2b2, perto de isogênico a 1/2) em placas de ágar de dextrose de batata (PDA). Mantenha as cepas separadamente.
2. Coloque as placas PDA listradas com U. maydis em uma incubadora de 30 °C por dois dias. Se usar um patógeno biotrófico diferente, use a tensão adequada, a mídia e as condições de crescimento. Monitore o crescimento do patógeno durante o período de dois dias para garantir que a cepa de Maydis dos EUA esteja crescendo bem.
3. Remova as placas PDA da incubadora após dois dias. As placas devem ter bom crescimento de patógenos e conter colônias únicas(Figura 2A). É importante obter colônias únicas. Se colônias únicas não estiverem presentes, recuem as placas em uma concentração menor.
4. Faça todo o trabalho em um capô de fluxo laminar. Use um palito estéril para selecionar uma única colônia para cada cepa das placas PDA. Coloque o palito contendo uma única colônia em um caldo de dextrose de batata de 3 ml (PDB). É aconselhável ter 2-3 culturas.
5. Coloque as culturas PDB de 3 ml em uma incubadora/agitador de 30 °C por dois dias a 200 rpm. Acompanhar o crescimento da cultura ao longo dos dois dias para garantir o crescimento da cultura. A cultura deve parecer muito nebulosa.
6. Remova as culturas líquidas da incubadora/shaker e meça a concentração em OD₆₀₀ para garantir que as células foram cultivadas a um OD de 1,0 (~1 x 10⁷ células/ml)¹⁷.
7. Leve as culturas de suspensão celular maydis dos EUA para uma concentração final de 1 x 10⁶ células/ml, usando água em um volume final de cultura de 30 ml. Essa concentração resulta consistentemente em uma boa infecção das plantas com a cultura de suspensão celular patógena. ¹⁷

Nota: Várias concentrações de suspensão celular devem ser testadas ao usar diferentes cepas de patógenos para determinar o título celular adequado necessário para a inoculação^18,19. A concentração final dada para a cultura de suspensão celular pode ser usada como ponto de partida para titulação. A concentração adequada da cultura de suspensão celular patógena deve ser verificada visualizando os fenótipos vegetais com boa infecção (Figuras 3A-E).

8. Misture volumes iguais das duas cepas U. maydis antes da inoculação. Se o uso de uma cepa de patógeno proceder à etapa 2.9. Prepare culturas frescas de suspensão celular U. maydis para cada experimento de inoculação e descarte culturas de suspensão celular após dois dias.
9. Para a inoculação experimental de injeção de agulha, encha uma seringa de 3 ml com a cultura de suspensão celular dos eua, puxando a cultura de suspensão celular para a seringa.
10. Para a inoculação de injeção de agulha de controle, encha uma seringa de 3 ml com água¹⁷. Use o mesmo procedimento para a inoculação experimental da injeção de agulha.
11. Conecte uma agulha hipodérmica de 0,457 mm x 1,3 cm ao final de cada seringa de 3 ml. O tamanho da agulha selecionada fornecerá a cultura de suspensão celular entre as folhas da planta com danos mínimos ao tecido vegetal.
12. Remova as plantas experimentais e de controle da câmara de crescimento 10 dias após o plantio em preparação para inoculações de injeção de agulha(Figura 2B) (ver passo 1.7).
13. Insira cuidadosamente a agulha hipodérmica contendo a cultura de suspensão celular U. maydis no caule de uma planta experimental em um ângulo de 90° logo acima da linha do solo. Insira a agulha até que esteja no meio da haste. Não empurre a agulha através da haste(Figura 2C).
14. Injete a planta experimental com cerca de 100 μl da cultura de suspensão celular maydis ^18,19. Isso vai variar ligeiramente dependendo da altura da muda. A cultura de suspensão celular vai empurrar através do caule e mover-se para o turbilhão da planta. A cultura de suspensão celular será visível no turbilhão da planta. Continue injetando 100 μl da cultura de suspensão celular em cada planta individual até que a seringa de 3 ml esteja vazia.
15. Após a injeção, remova cuidadosamente a agulha da haste da planta. Retire a agulha da seringa agora vazia de 3 ml e encha com água. Coloque a agulha de volta na seringa e empurre a água através da agulha para remover qualquer tecido vegetal que possa ser pego na ponta da agulha.
16. Repita as etapas 2.9-2.15 para cada planta experimental. Siga o mesmo protocolo para as plantas de controle injetando água.
17. Coloque as plantas experimentais e de controle inoculadas de volta na câmara de crescimento. Rega as plantas diariamente molhando o solo, não o tecido vegetal.
18. Verifique as plantas diariamente para detectar o desenvolvimento de patógenos e reações de resistência vegetal.

3. Triagem de reação de resistência

1. Escore e regise as reações de resistência para cada planta 7, 10, 14 e 21 dias pós-inoculação (dpi) usando uma escala de classificação de reação de resistência de 1 a 5. A gravidade da doença aumenta à medida que os valores numéricos na escala de classificação aumentam(Tabela 2). Uma reação de resistência de 1C (clorose da folha), 1A (produção de antocianina de folha) ou 2 (pequenas galos de folhas) indicam resistência. Uma reação de resistência de 3 (galos de haste), 4 (gail basal) ou 5 (morte vegetal) indica suscetibilidade(Figuras 3A-E e Tabela 2)^18,19.
2. Escore tanto plantas experimentais quanto de controle e classificações de reação de resistência recorde.
3. Compare as reações de resistência das plantas experimentais e de controle. Selecione plantas experimentais com uma classificação de reação de resistência de 1C, 1A ou 2. Essas plantas são consideradas resistentes aos U. maydis^18,19.
4. Repita todo o experimento para verificar os fenótipos da planta.

Resultados

Uma inoculação de injeção de agulha bem sucedida pode ser determinada visualizando o fenótipo das plantas inoculadas com U. maydis (experimental). A maioria das plantas experimentais eram suscetíveis à infecção por U. maydis. As plantas suscetíveis apresentaram desenvolvimento de doenças muito graves demonstradas pela formação de caule e gail basal com teliosporos pretos (Figuras 3D e 3E, Tabela 2). Várias plantas morreram após a inocula?...

Discussão

Neste estudo, o método de inoculação de injeção de agulha usado para fornecer uma cepa de U. maydis na haste de 700 plantas de milho e teosinto foi bem sucedido. Além disso, uma escala revisada de classificação de resistência à doença foi usada para rastrear as plantas e detectar o desenvolvimento de patógenos. Como resultado do uso de ambos os métodos, foram identificadas linhas vegetais resistentes aos maydis u. foram identificadas entre 700 plantas de milho e teosinto que agora podem ser...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321