Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Resumen

El aislamiento y cultivo de una población pura de células satélite quiescentes, una población de células madre de músculo, es esencial para la comprensión de la biología de células madre del músculo y la regeneración, así como el trasplante de células madre para terapias en la distrofia muscular y otras enfermedades degenerativas.

Resumen

Células satélite del músculo son una población de células madre necesaria para el desarrollo del músculo esquelético postnatal y la regeneración, que representan el 2-5% de núcleos sublaminal en las fibras musculares. En el músculo adulto, las células satélite son normalmente mitóticamente quiescentes. Después de una lesión, sin embargo, las células satélite inician la proliferación celular para producir mioblastos, sus progenies, para mediar en la regeneración del músculo. El trasplante de mioblastos derivados de células de satélite ha sido ampliamente estudiado como una posible terapia para varias enfermedades regenerativas, incluyendo la distrofia muscular, la insuficiencia cardíaca y la disfunción urológica. El trasplante de mioblastos en el músculo distrófico esquelético, corazón infartado, y el disfuncionamiento conductos urinarios ha demostrado que los mioblastos injertados pueden diferenciarse en las fibras musculares en los tejidos del huésped y mostrar mejoría funcional parcial en estas enfermedades. Por lo tanto, el desarrollo de métodos de purificación eficientes de las células satélite quiescentes de muscl esqueléticoelectrónico, así como el establecimiento de cultivos de mioblastos satélite derivados de células y métodos de trasplante de mioblastos, son esenciales para la comprensión de los mecanismos moleculares detrás de la auto-renovación de células satélite, activación y diferenciación. Además, el desarrollo de terapias basadas en células para la distrofia muscular y otras enfermedades regenerativas también son dependientes de estos factores.

Sin embargo, los métodos de purificación posibles actuales de las células satélite quiescentes requieren el uso de caros fluorescencia de clasificación de células activadas máquinas (FACS). A continuación, presentamos un nuevo método para la purificación rápida, económica y fiable de las células satélite en reposo de ratón músculo esquelético adulto por disociación enzimática seguida de células activadas por la clasificación magnética (MACS). Tras el aislamiento de las células satélite quiescentes puros, estas células pueden ser cultivadas para obtener un gran número de mioblastos después de varios pasajes. Estos recién aisladascélulas satélite quiescentes o ex vivo mioblastos expandidas pueden ser trasplantados en cardiotoxina (CTX) inducida por la regeneración de músculo esquelético de ratón para examinar la contribución de las células derivadas del donante a la regeneración de las fibras musculares, así como a los compartimentos de células satélite para el examen de auto-renovación actividades.

Introducción

Células satélite del músculo son una pequeña población de células madre miogénicas ubicados debajo de la lámina basal de las fibras musculares esqueléticas. Se caracterizan por la expresión de Pax7, Pax3, c-Met, M-cadherina, CD34, syndecan-3, y la calcitonina ^{1 - 3.} Las células satélite han demostrado ser responsables de la regeneración muscular como células madre de músculo. En el músculo adulto, las células satélite son normalmente mitóticamente quiescentes ^4-8. Después de la lesión, las células satélite se activan, iniciar la expresión de MyoD, y entrar en el ciclo celular para expandir su progenie, denominada células precursoras miogénicas o mioblastos ^3. Después de varias rondas de división celular, mioblastos salir del ciclo celular y se fusionan entre sí con el fin de someterse a la diferenciación en miotubos multinucleadas, seguido por fibras musculares maduras. Los mioblastos aislados de músculo adulto fácilmente se pueden expandir ex vivo. La capacidad de los mioblastos para convertirse en fibras musculares en la regeneración muscular y paraforman fibras musculares ectópico en los tejidos no musculares es explotada por el trasplante de mioblastos, un enfoque terapéutico potencial para distrofia muscular de Duchenne (DMD) ^4, disfunción urológica ^9, y la insuficiencia cardiaca ^10. De hecho, los mioblastos se han trasplantado con éxito en el músculo de mdx ambos (modelo DMD) ratones y pacientes con DMD ^11-14. Los mioblastos normales inyectados se fusionan con las fibras musculares de acogida para mejorar la histología y la función del músculo enfermo. Trabajos anteriores demostraron que las subpoblaciones de mioblastos son más células madre similares, y permanecen en un estado indiferenciado ya en el músculo durante la regeneración muscular ^5. Trabajos recientes han demostrado que las células satélite recién aisladas de músculo adulto contienen una población de células madre similares a las que presenta el injerto más eficiente y la actividad de auto-renovación en la regeneración muscular ^5-8. Por lo tanto, la purificación de una población pura de células satélite quiescentes de MU esquelético adultoSCLE es esencial para la comprensión de la biología de las células satélite, mioblastos y la regeneración muscular, y para el desarrollo de terapias basadas en células.

Sin embargo, los métodos de purificación posibles actuales de las células satélite quiescentes requieren el uso de un activadas por fluorescencia caro clasificación de células (FACS) de la máquina ^1,2,6-8. Además, la exposición al láser FACS tiende a inducir la muerte celular durante la separación, lo que provoca un menor rendimiento de las células satélite de reposo ^15. A continuación, presentamos un nuevo método para la purificación rápida, económica y fiable de las células satélite en reposo desde el músculo esquelético de ratones adultos. Este método utiliza la disociación enzimática seguida por magnético de células activadas por la clasificación (MACS). Tras el aislamiento de las células satélite quiescentes puros, estas células pueden ser cultivadas para obtener un gran número de mioblastos después de varios pasajes. También ponen de manifiesto que la inyección intramuscular de estas células satélite quiescentes recién aisladas o ex vimioblastos vo expandidas pueden ser trasplantados en cardiotoxina (CTX) inducida por la regeneración del músculo esquelético del ratón para examinar la contribución de las células derivadas del donante de la regeneración de las fibras musculares, así como a los compartimentos celulares satelitales para el examen de las actividades de auto-renovación.

Protocolo

Los animales fueron alojados en un entorno SPF y fueron supervisadas por los recursos animales de investigación (RAR) de la Universidad de Minnesota. . Los animales fueron sacrificados por los medios adecuados (CO ₂ inhalación o inyección KCl tras ser anestesiados con inyección IP de Avertin (250 mg / kg) Todos los protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC, Número de Código: 1.304-30.492 ) de la Universidad de Minnesota.

1. Aislamiento de células mononucleares de músculo esquelético del ratón

1. Correctamente sacrificar 1 o 2 ratones adultos jóvenes (3-8 semanas).
   1. Pinch y cortar la piel del abdomen con unas tijeras afiladas. Pele apagado la piel para mostrar completamente tríceps y los músculos de las extremidades posteriores (tirar de la piel en direcciones opuestas).
   2. Retire todos los músculos de las piernas esqueléticas (tibial anterior, gemelos y cuádriceps) y tríceps largo de los huesos con tijeras. A continuación, traslado músculos para helado, PBS estéril en una placa de 10 cm.
2. Lave sangre de los músculos en PBS y los músculos de transferencia a una nueva placa de 6 cm estéril: 1 plato de 1-2 ratones.
3. Quitar el tejido conectivo, vasos sanguíneos, haces de nervios, y el tejido adipogénica bajo un microscopio de disección.
4. Con unas tijeras para oftalmología, cortar y picar el tejido en una pulpa suave (Figuras 1A y 1B). Trate de no dejar trozos grandes, ya que no se descomponen fácilmente por la solución de enzima.
5. Transferencia músculos picada en un tubo Falcon de 50 ml, y añadir 5 ml de solución de colagenasa (0,2% de colagenasa de tipo 2 en 10% de FBS en DMEM). Incubar a 37 ° C durante 60 min.
6. Triturar (arriba y abajo con una aguja de 18 G) para homogeneizar la mezcla (Figura 1C). Entonces se incuba adicionalmente la mezcla a 37 ° C durante 15 min.
7. Se tritura de nuevo para homogeneizar la mezcla a disociarse en suspensión de células individuales. Añadir 2% de FBS en DMEM hasta 50 ml en la suspensión de células individuales y mezclarasí.
8. Coloque un filtro celular (70 micras) en un tubo Falcon de 50 ml (Figura 1D). Transferir el sobrenadante que contiene las células disociadas en un filtro de células, y la pipeta la suspensión celular arriba y abajo en el filtro hasta que pasa a través.
9. Contar el número de células por hemocitómetro. Centrifugar los tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
10. Resuspender con 10 ml de 2% de FBS en DMEM. Centrifugar los tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
11. Resuspender con 200 l de 2% de FBS en DMEM y la transferencia de suspensión celular en 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Por lo general, alrededor de 2 x 10 ⁶ células deben recolectarse de los músculos de 1 ratón. Las células se diluyeron a una concentración de 1 x 10 ⁶ células en 100 l de 2% de FBS en DMEM.

2. Anticuerpo tinción y separación con MACS

Durante los siguientes procedures, mantener las condiciones estériles mediante el uso de tampones estériles. Cada volumen de anticuerpos añadió y se calcula medio de suspensión de células para las células de los músculos enteros de 1 de ratón. Si las células se cosechan a partir de 2 o más ratones, la cantidad de reactivos debe ser optimizado.

1. Añadir 1 l de cada uno de CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, y la integrina anticuerpo α7 en 200 l de la suspensión celular. Incubar en hielo durante 30 min.
2. Lavar las células: Después de la incubación, añadir 1 ml de 2% de FBS en DMEM en la suspensión de células en el tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita este paso dos veces.
3. Aspirar y desechar el sobrenadante.
4. Resuspender las células con 200 l de 2% de FBS en DMEM, y añadir 10 l de anti-PE perlas magnéticas. Incubar en hielo durante 30 min.
5. Lavar las células: Después de la incubación, añadir 1 ml de tampón MACS a la suspensión de células en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y luego centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita este paso twhielo. Tenga en cuenta que las células se deben lavar a tampón MACS antes de ser separados por la columna magnética.
6. Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspender las células con 1,0 ml de tampón de MACS.
7. Configure la columna LD en un tablero magnético, y enjuagar la columna con 2,0 ml de tampón MACS (Figura 1E).
8. Transferir la suspensión celular en la columna de la LD, y recoger la fracción de flujo a través en un tubo de 1,5 ml. Esta fracción contiene células-PE negativa.
9. Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min, aspirado y descartar el sobrenadante.
10. Resuspender las células con 200 l de 2% de FBS en DMEM, y añadir 10 l de IgG anti-ratón perlas magnéticas. Incubar en hielo durante 30 min.
11. Lavar las células: Después de la incubación, añadir 1 ml de tampón de MACS en la suspensión de células en un tubo de 1,5 ml, y luego centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Aspirar y desechar el sobrenadante. Repita este paso dos veces. Resuspender las células con 500 l de tampón de MACS.
12. Configure la columna MS en un tablero magnético, y enjuagar la columna con 500 l de tampón MACS (Figura 1F).
13. Transferencia suspendido solución de células en la columna de la MS, y descartar la fracción de flujo a través (células-α7 negativo de integrina).
14. Enjuague con 1 ml de tampón de MACS, y repita este paso dos veces.
15. Después de enjuagar, quitar la columna del campo magnético de separador. Aplicar 1,0 ml de tampón MACS a la columna, y la elución de las células marcadas magnéticamente (células α7-positivo de integrina) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml empujando el émbolo de la jeringa desde la parte superior de la columna. Recoger el flujo a través en un tubo de 1,5 ml. Repetir la elución con 1,5 ml de tampón MACS y se recoge el flujo a través.
16. Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min, aspirado y descartar el sobrenadante.
17. Resuspender las células purificadas con 1 ml de medio de mioblastos (20% de FBS contenía Hams F-10 con el bFGF), y células de la placa sobre recubiertas con Matrigel 10 cmplaca con 8 ml de mioblastos Medium (5 ml en placa de 6 cm) (Figura 1G). Tenga en cuenta que 1-2 x 10 ⁵ células potencialmente se pueden aislar de 1 músculo de ratón intacto.

3. Mantenimiento

1. Alimentar células cada dos días con medio de mioblastos. La aparición de mioblastos en crecimiento es de una forma pequeña y redonda expresar MyoD (Figura 2) y Pax7 (datos no mostrados) en su núcleo.
2. Los mioblastos deben ser pasados ​​antes de 50% de confluencia o cuando se inicia la fusión celular. Después de enjuagar una vez con PBS, se incuban las células con solución de tripsina al 0,25% a 37 ° C durante 3 min en un incubador de _CO2 y recoger las células disociadas con medio de mioblastos. Después de centrifugar las células (1000 rpm durante 5 min), suspender con medio de mioblastos y replate células sobre nuevas placas recubiertas con Matrigel. Placas recubiertas de colágeno se pueden utilizar después del paso 3. Una placa por lo general se puede dividir en cuatro y cincuenta y siete placas.

4. Differenciación

1. Vuelva a introducir con medio de diferenciación cada dos días.
2. Por día 1 en medio de diferenciación, mioblastos salir del ciclo celular y se someten a diferenciación en cadena de la miosina pesada (MHC)-positivo miocitos. Estos myoctyes comienzan la fusión celular entre sí para generar miotubos multinucleados. Típicamente, la mayoría de los mioblastos se convierten en miocitos mononucleares de diferenciación de MHC-positivos o miotubos (Figura 2) por día 3-5 en medio de diferenciación.

5. Mioblastos Trasplante en ratón para la regeneración del músculo esquelético

1. Anestesiar el ratón con Avertin (250 mg / kg) por inyección intraperitoneal (IP) de inyección.
2. Afeitar el pelo de la piel alrededor de anterior (TA) músculo tibial. Veinticuatro horas antes del trasplante de mioblastos, 10 mM CTX (50 l) se inyecta por vía intramuscular en el NOD / músculo de ratón SCID TA para inducir la regeneración del músculo a través de una jeringa de 31 G de insulina a través de la piel afeitada (figura60, 3).
3. Mioblastos proliferantes se disocian con solución de tripsina al 0,25%, y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspender 1 x 10 ⁶ células con 50 l de 2% de FBS en DMEM. Transferir las células suspendidas en una jeringa de insulina 31 G.
4. Los ratones receptores se anestesiaron con Avertin (250 mg / kg) por inyección IP, y las de 1 x 10 ⁶ mioblastos (Figura 2) se inyecta en forma intramuscular regenerar músculo TA.
5. Cosecha músculo TA por 1-4 semanas después de la inyección de células para el análisis histológico (Figura 3).

Resultados

Recién aisladas células satélite quiescentes muestran un pequeño, forma redonda (Figura 1G), y Pax7 expresa como un marcador definitivo de las células satélite en reposo. Más del 90% de las células recién aisladas expresar Pax7 (Figura 1H y 1I). Mayoría de las células son contaminados a partir de células de la sangre que no crecen de manera eficiente in vitro después de condiciones de cultivo de mioblastos. Por lo tanto, los mioblastos der...

Discusión

En este protocolo, las células satélite quiescentes se pueden purificar fácilmente a partir de músculo esquelético de los ratones adultos mediante digestión con colagenasa y la superficie mediada por anticuerpos separación MACS. Este método tarda aproximadamente 6 horas y no necesita ningún equipo costoso tal como una máquina de FACS. Además, este método es relativamente barato en comparación con la superficie mediada por anticuerpos FACS separación. Un mayor rendimiento de las células satélite de reposo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipette	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
Reagents			Recipe
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium			500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.