Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Özet

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Özet

Kas uydu hücreleri kas lifleri sublaminal çekirdekleri% 2-5 için muhasebe, doğum sonrası iskelet kas gelişimi ve yenilenmesi için gerekli bir kök hücre nüfus vardır. Yetişkin kas olarak, uydu hücreleri, normal olarak sakin mitotikal olarak bulunmaktadır. Yaralanma sonrasında, ancak, kas uydu hücreleri, rejenerasyonunu aracılık etmek miyoblastları kendi yavrularıyla üretmek için hücre çoğalmasını başlatabilir. Uydu hücresinden türetilmiş miyoblastların nakli yaygın müsküler distrofi, kalp yetmezliği, ve ürolojik işlev bozukluğu dahil olmak üzere birçok reaktif hastalıklar için olası bir tedavisi olarak incelenmiştir. Distrofik iskelet kası, enfarkte kalp ve disfonksiyonu idrar kanallarına Miyoblast nakli engrafted miyoblastlardır, ev sahibi dokulardaki kas lifleri farklılaşmak ve bu hastalıklarda kısmen fonksiyonel iyileşme görüntüleyebilir göstermiştir. Bu nedenle, iskelet muscl ikinci hareketsiz uydu hücrelerin verimli saflaştırma yöntemlerinin geliştirilmesie yanı sıra uydu hücre kaynaklı myoblast kültürler ve miyoblastların için nakli yöntemlerinin kurulması gibi, uydu hücre kendini yenileme, aktivasyonu ve farklılaşması arkasında moleküler mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Buna ek olarak, kas distrofisi ve diğer hastalıklar için rejeneratif hücre bazlı terapiler geliştirilmesi, aynı zamanda, bu faktörlere bağlıdır.

Ancak, sakin uydu hücrelerin prospektif saflaştırma yöntemleri pahalı floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) makinalarının kullanımını gerektirir. Burada, (MACS) manyetik ayırma ile aktive edilmiş hücre ardından enzimsel aynşma ile yetişkin fare iskelet kasından hareketsiz uydu hücreleri, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir saflaştırma için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Saf hareketsiz uydu hücrelerin izolasyonundan sonra, bu hücreler, birkaç geçiş sonrasında miyoblastların sayıda elde edilmesi için kültürlenebilir. Bu taze izole edilmişsakin uydu hücreleri veya ex vivo genişletilmiş miyoblastlardır kalbi etkileyen naklediliyor olabilir (CTX) kas lifleri rejenere için donör kaynaklı hücrelerin katkısını incelemek için fare iskelet kas yenileyici kaynaklı, hem de kendini yenileme incelenmesi için uydu hücre bölmelerine faaliyetleri.

Giriş

Kas uydu hücreleri iskelet kas liflerinin bazal lamina altında bulunan miyojen kök hücrelerin küçük bir nüfus vardır. Bunlar Pax7, Pax3, c-Met, M-kaderin, CD34, sindekan-3 ekspresyonu ile karakterize edilir ve kalsitonin ^{1 - 3.} Uydu kas hücreleri, kök hücreleri gibi kas rejenerasyon sorumlu olduğu kanıtlanmıştır. Erişkin kas, uydu hücreler normalde ^4-8 mitotikal durgundur. Yaralanma sonrasında, uydu hücreleri MyoD ekspresyonunu başlatmak ve bunların döl genişletmek için hücre döngüsüne girmelerini, aktive edilir, miyojenik öncü hücreleri veya miyoblastları ³ olarak adlandırılır. Hücre bölünmesinin birkaç tur sonra miyoblastlardır olgun kas lifleri ve ardından çok çekirdekli miyotüplerinin içine farklılaşmasını geçmesi amacıyla birbirine hücre döngüsü ve sigorta çıkar. Erişkin kas izole miyoblastlardır kolayca ex vivo genişletilebilir. Kas yenileyici ve kas lifleri olmak miyoblastların için kapasitenonmuscle dokularda form ektopik kas lifleri myoblast nakli, Duchenne müsküler distrofi (DMD) ⁴ için potansiyel bir tedavi yaklaşımı, ürolojik disfonksiyon ^9, ve kalp yetmezliği ¹⁰ tarafından istismar edilmektedir. Nitekim, miyoblastlardır başarıyla hem mdx (DMD modeli) fareler ve DMD hastalarında ^11-14 kas nakil edilmiştir. Enjekte Normal miyoblastlardır hastalıklı kas histoloji ve işlevini geliştirmek için konak kas lifleri ile sigorta. Önceki iş miyoblastların subpopülasyonunun fazla hücre-benzeri kök ve kas rejenerasyon ⁵ sırasında kas uzun bir farklılaşmamış durumda kalır olduğunu göstermiştir. Son çalışmalar, yetişkin kas uydu hücreleri, taze izole edilmiş kas ^5-8 rejenere daha verimli uyumunu ve kendini yenileme aktivite sergileyen bir kök hücre benzeri popülasyonu içeren göstermiştir. Bu nedenle, yetişkin iskelet mu ikinci hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfus saflaştırılmasıSCLE uydu hücreleri, kas iskelet hücreleri ve yenilenme biyolojisi anlamak için ve hücre bazlı terapiler geliştirilmesi için önemlidir.

Ancak, sakin uydu hücrelerin prospektif saflaştırma yöntemleri pahalı bir floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) makine ^1,2,6-8 kullanılmasını gerektirir. Buna ek olarak, lazer FACS maruz hareketsiz uydu hücrelerin ¹⁵ daha düşük verim neden ayrılması sırasında, hücre ölümüne neden olma eğilimindedir. Burada, yetişkin fare iskelet kasından hareketsiz uydu hücreleri, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir saflaştırma için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, (MACS) manyetik ayırma ile aktive edilmiş hücre ardından enzimatik ayrışma kullanır. Saf hareketsiz uydu hücrelerin izolasyonundan sonra, bu hücreler, birkaç geçiş sonrasında miyoblastların sayıda elde edilmesi için kültürlenebilir. Ayrıca göstermektedir ki bu yeni izole edilmiş hareketsiz uydu hücrelerin ya da eski vi intramüsküler enjeksiyonuvo genişletilmiş miyoblastlardır kalbi etkileyen naklediliyor olabilir (CTX) kas lifleri yanı sıra, kendini yenileme faaliyetlerinin incelenmesi için uydu hücre bölmelerine yenileyici için donör kaynaklı hücrelerin katkısını incelemek için fare iskelet kas yenileyici kaynaklı.

Protokol

Hayvanlar, bir SPF ortamında barındırıldı ve Research Animal Resources Minnesota Üniversitesi (RAR) ile izlendi. . Animals (Avertin (250 mg / kg) IP enjeksiyonu ile anestezi sonra _CO2 inhalasyon veya püskürtme KCl uygun araçlar ile kurban edilmiştir tüm protokoller, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC, kod numarası tarafından onaylanmıştır: 1304-30492 ) Minnesota Üniversitesi.

Fare İskelet Kası Mononükleer Hücreleri 1. İzolasyon

1. Düzgün 1 ya da 2 genç erişkin fareler (3-8 hafta) kurban.
   1. Çimdik ve keskin bir makas ile karın cildi yarık. Tamamen (yön karşı cildi çekin) triseps ve arka bacak kas göstermek için deri soyulabilir.
   2. Makasla kemiklerinden tüm bacak iskelet kasları (tibialis anterior, gastrokinemius ve kuadriseps) ve triseps çıkarın. Daha sonra, 10 cm plaka içinde buz soğukluğunda steril PBS'ye transferi kasları.
2. Yeni bir steril 6 cm plaka PBS kasları ve transfer kasları kan yıkayın: 1 tabak 1-2 fareler için.
3. Bir diseksiyon mikroskobu altında bağ dokusu, kan damarları, sinir demetleri ve adipogenic doku çıkarın.
4. (Şekil 1A ve 1B) kesilmiş ve pürüzsüz bir hamur haline doku kıyma, Oftalmoloji için makas kullanma. Bu enzim solüsyonu ile kolayca aşağı kırık olmayacak gibi büyük parçaları bırakmamaya çalışın.
5. Bir Falcon 50 ml tüp içine kıyılmış kas transferi, ve kolajenaz çözeltisi (% 0.2 'lik kolajenaz Tip DMEM içerisinde 2,% 10 FBS) 5 ml. 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
6. Öğütün (yukarı ve aşağı 18 G iğne ile) karışımı (Şekil 1C) homojenize etmek. Daha sonra 15 dakika daha 37 ° C'de inkübe karışımı.
7. Tek bir hücre süspansiyonu içine ayırmak için karışımın homojenize edilmesi tekrar toz haline getirin. Kadar olan tek bir hücre süspansiyonu içine 50 ml DMEM içinde% 2 FBS ilave et ve karıştıriyi.
8. Falcon 50 ml'lik bir tüp (Şekil 1D) üzerine bir hücre süzgeç (70 mikron) yerleştirin. Bir hücre süzgeç üzerine ayrışmış hücreleri içeren süpernatant aktarın ve geçer kadar aşağı ve filtre üzerinde hücre süspansiyonu pipetle.
9. Hemositometreyle hücre sayısını sayın. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj tüpleri; aspirat ve süpernatant atın.
10. DMEM içinde 10 ml% 2 FBS ile yeniden süspanse edin. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj tüpleri; aspirat ve süpernatant atın.
11. 200 DMEM içinde% 2 FBS ul ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine transferi hücre süspansiyonu ile yeniden süspanse edin. Genellikle, yaklaşık 2 x 10 ⁶ hücre 1 fare kaslardan hasat edilmelidir. Hücreler, DMEM içinde% 2 FBS 100 ul içinde 1 x 10 ⁶ hücre bir konsantrasyona seyreltilmiş olacaktır.

2.. Antikor Boyama ve MACS ile Ayırma

Aşağıdaki pr sırasındaocedures, steril tamponlar kullanılarak steril koşullarda muhafaza. Antikorların her biri hacmi eklenmiş ve hücre süspansiyon ortamı 1 fare, tüm kas hücreleri için hesaplanır. Hücreler 2 ya da daha fazla fareden hasat edilir ise, reaktifler miktarının optimize edilmelidir.

1. 1 ul CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE ve hücre süspansiyonu 200 ul içine İntegrin α7 antikorun her ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
2. Hücreleri yıkayın: kuluçkalamadan sonra, 1.5 ml bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu içine DMEM içinde 1 ml% 2 FBS ekleyin ve 3 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj. Iki kez bu adımı tekrarlayın.
3. Aspire ve süpernatant atın.
4. 200 DMEM içinde% 2 FBS ul ve Anti-PE Manyetik boncuklar 10 ul ekle ile yeniden süspanse edin hücreleri. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
5. Hücreleri yıkayın: kuluçkalamadan sonra, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu MACS tamponu 1 ml ekleyin ve daha sonra 3 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj. Bu adımı tw tekrarlayınbuz. Hücreleri manyetik sütun ayrılmış önce MACS tamponu ile yıkanmıştır gerektiğini not edin.
6. Aspire ve süpernatant atın. MACS tamponu 1.0 ml hücreleri yeniden süspanse edin.
7. Manyetik gemide LD sütun kurmak ve MACS tamponu (Şekil 1E) 2.0 ml sütun durulayın.
8. LD kolonuna hücre süspansiyonu aktarın ve 1.5 ml tüp içine-akış fraksiyonu toplamak. Bu fraksiyon PE-negatif hücreleri içerir.
9. 3 dakika, aspirat ve süpernatantı atmak için 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj.
10. 200 DMEM içinde% 2 FBS ul ve anti-fare IgG Manyetik boncuklar 10 ul ekle ile yeniden süspanse edin hücreleri. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
11. Hücreleri yıkayın: kuluçkalamadan sonra, 1.5 ml bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu içine MACS tamponu 1 ml ekleyin ve daha sonra 3 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj. Aspire ve süpernatant atın. Iki kez bu adımı tekrarlayın. MACS tamponu 500 ul hücreleri tekrar.
12. Manyetik gemide MS sütun kurmak ve MACS tamponu (Şekil 1F) 500 ul ile sütun durulayın.
13. Aktarım MS kolona hücre çözümü süspansiyon haline getirildi ve akış boyunca fraksiyonu (İntegrin α7-negatif hücreleri) atın.
14. MACS 1 ml tampon ile durulayın, ve iki kez bu adımı tekrarlayın.
15. Duruladıktan sonra, ayırıcı manyetik alandan sütun kaldırmak. Kolona MACS tamponu içinde 1.0 ml uygulayın ve kolonun üstünden şırınga pistonu iterek bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerin (İntegrin α7-pozitif hücreleri) elute. 1.5 ml tüp içine flow-through toplayın. MACS tamponu, 1.5 ml ile elüsyon tekrarlayın ve akış yoluyla toplayın.
16. 3 dakika, aspirat ve süpernatantı atmak için 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj.
17. Miyoblast ortamı, 1 ml saflaştırılmış hücrelerin tekrar (% 20 FBS bFGF ile Hams F-10 içeren) ve Matrigel kaplı 10 cm plaka hücreleriMiyoblast Orta 8 ml (6 cm bir plaka içerisinde 5 mi) (Şekil 1G) ile plaka. 1-2 x 10 ⁵ hücre potansiyel olarak 1 dokunulmamış fare kas izole edilebilir unutmayın.

3. Bakım

1. Miyoblast ortamı ile her geçen gün hücreleri besleyin. Artan miyoblastların görünümü çekirdeklerinde MyoD (Şekil 2) ve Pax7 (veriler gösterilmemiştir) eksprese eden bir küçük ve yuvarlak şekle sahiptir.
2. Hücre füzyon başlatırken iskelet hücreleri% 50 birleştiği önce ya da geçişli olmalıdır. Bir kez PBS ile yıkandıktan sonra, bir _CO2 kuluçka makinesi içinde 3 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin solüsyonu ile inkübe edilir ve hücreleri Miyoblast ortam maddesi ile ayrışmış hücreleri toplamak. Santrifüj hücreleri (5 dakika boyunca 1000 rpm) sonra, Miyoblast ortamı ile askıya ve yeni Matrigel kaplı plakalar üzerine hücreleri replate. Kollajen kaplanmış plakalar geçit 3 sonra kullanılabilir. Bir plaka, genellikle 3-5 plakalar halinde bölünebilir.

4. Yönünrentiation

1. Her gün Farklılaşma Orta ile yeniden yükleme.
2. Farklılaşma Ortamda 1. günde, miyoblastlardır hücre döngüsünden çıkmak ve miyozin ağır zincir (MHC)-pozitif miyositler içine farklılaşma tabi. Bu myoctyes çok çekirdekli miyotüplerinin oluşturmak için birbirleriyle hücre füzyon başlar. Tipik olarak, en miyoblastlardır MHC-pozitif farklılaştırıcı çekirdekli miyositler veya miyotüpleri Farklılaşma Orta günde 3-5 (Şekil 2) olur.

İskelet kas Rejenerasyon için Fare içine 5. Miyoblast Transplantasyon

1. Intraperitonal (IP) enjeksiyon ile Avertin (250 mg / kg) ile fare anestezi uygulayın.
2. Tibialis anterior (TA) kas üzerindeki deri saç etrafında tıraş. Yirmi dört saat miyoblast transplantasyonundan önce, 10 uM CTX (50 ul), kas içinden traş edilmiş derisine (Şekil yoluyla bir 31 G insülin şırınga ile kas yenilenmesini meydana Nod / Scid fare TA kas içine enjekte60, 3).
3. Proliferatif miyoblastlardır% 0.25 tripsin solüsyonu ile ayrıştırılmış, ve 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüje tabi tutulur. Aspire ve süpernatant atın. DMEM içinde% 2 FBS ile yeniden süspanse edin, 50 ul 1 x 10 ⁶ hücre. Bir 31 G insülin şırınga içine askıya hücreleri aktarın.
4. Alıcı farenin IP enjeksiyonu ile Avertin (250 mg / kg) ile anestezi edilir, ve 1 x 10 ⁶ miyoblastlardır (Şekil 2), kas içinden, kas TA yenileyici içine enjekte edilir.
5. Histolojik analiz için hücre enjeksiyonu (Şekil 3) sonrasında 1-4 hafta hasat TA kas.

Sonuçlar

Taze izole sakin uydu hücreler pasif uydu hücreler için kesin bir belirteç olarak küçük, yuvarlak bir şekil (Şekil 1G) ve ekspres Pax7 gösterilecek. Taze izole hücrelerin% 90'dan fazlası Pax7 (Şekil 1H ve 1I) ifade eder. En çok kirlenmiş miyoblast hücreleri verimli bir şekilde kültür koşulları aşağıdaki in vitro olarak büyümez kan hücreleri bulunmaktadır. Bu nedenle, uydu hücre türetilmiş miyoblastlardır kültüründe hakim. ...

Tartışmalar

Bu protokol, hareketsiz uydu hücreleri kolayca kollajenaz sindirimi ve yüzey antikor aracılı MACS ayırma ile farelerin yetişkin iskelet kasından saflaştırılabilir. Bu yöntem, yaklaşık olarak 6 saat sürer ve bir makine gibi bir FACS pahalı ekipman gerek yoktur. Buna ek olarak, bu yöntem, yüzey antikor aracılı FACS ayrımına göre daha ucuzdur. FACS lazer maruz ayrılması sırasında ¹⁵ hücre ölümüne neden olmaya eğilimli olduğu için pasif uydu hücrelerin daha yüksek bir verim, ayn...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipette	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
Reagents			Recipe
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium			500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.