Análisis sistemático de<em&gt; In Vitro</em&gt; Celda balanceo Utilizando un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos

Resumen

En este estudio se utilizó un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos, aumentando significativamente el rendimiento de los estudios de laminación celular bajo flujo cortante fisiológicamente relevante. Dada la importancia de la laminación celular en la célula de múltiples pasos homing cascada y la importancia de homing de las células después de la entrega sistémica de las poblaciones de células exógenas en los pacientes, este sistema ofrece un potencial como una plataforma de cribado para mejorar la terapia basada en células.

Resumen

Un reto importante para la terapia basada en células es la incapacidad para apuntar sistémicamente una gran cantidad de células viables con una alta eficiencia a los tejidos de interés después de la infusión intravenosa o intraarterial. En consecuencia, el aumento de homing de células se estudia en la actualidad como una estrategia para mejorar la terapia celular. Celular a rodar sobre el endotelio vascular es un paso importante en el proceso de homing de las células y se puede probar in vitro usando una cámara de flujo de placas paralelas (PPFC). Sin embargo, esta es una, ensayo bajo rendimiento extremadamente tedioso, con condiciones de flujo mal controlados. En lugar de ello, se utilizó un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos que permite el estudio de las propiedades de laminación celular en un rendimiento superior bajo controlada con precisión, por flujo de cizallamiento fisiológicamente relevante ^1,2. En este trabajo, se muestra cómo las propiedades de rodadura de HL-60 (leucemia promielocítica humana) en las superficies de las células E-selectina recubierto P-y al igual que en las superficies de una sola capa con recubrimiento de células pueden ser readilY examinó. Para simular mejor las condiciones inflamatorias, la superficie del canal microfluídico se revistió con células endoteliales (EC), que luego se activaron con factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), aumentando significativamente interacciones con células HL-60 bajo condiciones dinámicas. El rendimiento mejorado y multi-plataforma de análisis de parámetros de software integrado, que permite un rápido análisis de parámetros tales como la laminación velocidades y el camino de rodadura, son ventajas importantes para evaluar las propiedades de celda Rolling In-vitro. Permitiendo el análisis rápido y preciso de los enfoques de ingeniería diseñados para impactar de laminación celular y homing, esta plataforma puede ayudar a la terapia basada en células exógeno antelación.

Introducción

Uno de los principales retos en la traducción clínica de éxito de la terapia basada en células es la entrega ineficiente o la orientación de las células infundidas por vía sistémica a los sitios deseados ^3,4. En consecuencia, hay una búsqueda constante de métodos para mejorar homing de células y célula específicamente a rodar, como una estrategia para mejorar la terapia celular. Celular rodando en los vasos sanguíneos es un paso clave en la cascada de homing de células, clásicamente definida para los leucocitos que son reclutados a sitios de la enfermedad ^5. Este paso se rige por interacciones específicas entre las selectinas del endotelio, es decir, P-y E-selectina sus ligandos contador en la superficie de los leucocitos ^5,6 (P-y E-SEL), y. Una mejor comprensión y una mejor eficiencia de homing de las células, y específicamente la etapa de laminación, son de gran importancia en la búsqueda de nuevas plataformas para mejorar la terapia basada en células. Hasta la fecha esto se ha logrado mediante el uso de cámaras de flujo de placa paralelos (PPFCs), que comprende dos plat planaES con una junta entre ellos, con un puerto de flujo de entrada y flujo de salida situado en la placa superior, a través del cual una suspensión de células se perfunde mediante el uso de una bomba de jeringa de ^{7,8, 9.} La superficie de la placa inferior puede estar recubierto con una monocapa de células / sustratos relevantes y la interacción entre las células perfundidos y la superficie bajo flujo de cizallamiento es entonces exploró ^7. Sin embargo, PPFC es un rendimiento bajo, reactivo de consumo y el método bastante tedioso, con la formación de burbujas, las fugas, y el flujo de un mal control de la presentación de los principales inconvenientes.

Una técnica alternativa a la PPFC tradicional es un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos, lo que permite un mayor rendimiento rendimiento de ensayos celulares (hasta 10 veces más alta que PPFCs) bajo, flujo preciso de cizallamiento controlado por ordenador, con un bajo consumo de reactivos ^1,10. Experimentos de rodadura de la célula se llevan a cabo dentro de los canales microfluídicos, que puede ser recubierto con monocapas de células o sustratos de ingeniería y la imagen USIng un microscopio, con propiedades de rodadura analizó fácilmente utilizando un software adecuado. En este estudio, hemos demostrado las capacidades de este sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos mediante el estudio de las propiedades de rodadura de (HL-60) las células en diferentes superficies de la leucemia promielocítica humana. HL-60 que rueda sobre sustratos como, se analizó P-y E-SEL, así como sobre monocapas de células que expresan diferentes receptores de rodadura. Además, el anticuerpo (Ab) de bloqueo se utiliza para demostrar la participación directa de selectinas específicos en la mediación del movimiento de rodadura de HL-60 en esas superficies. Experimentos de laminación se realizaron con mayor rendimiento, bajo un flujo estable al cizallamiento, con el mínimo consumo de reactivos / célula, permitiendo el análisis eficiente de los parámetros de rodadura clave como la velocidad de rotación, el número de células que ruedan y ruedan propiedades de la ruta.

Protocolo

1. Cultivo Celular

1. Células (HL-60) leucemia promielocítica humana
   1. Cultura células HL-60 en 75 cm ² frascos con 15 ml de Iscove modificado de Dulbecco Medio (IMDM), suplementado con 20% (v / v) de suero bovino fetal (FBS), 1% (v / v) L-glutamina y 1 % (v / v) penicilina-estreptomicina.
   2. Cambio de medio cada 3 días por aspiración de la mitad del volumen de suspensión celular y su sustitución por medios IMDM completo.
   3. Para diacetato de carboxifluoresceína, succinimidil éster (CFSE) tinción, centrífuga de HL-60 suspensión de células (400 x g, 5 min), se resuspende en una solución 1 M de CFSE (preparado en PBS precalentado) e incubar durante 15 min a 37 ° C. Luego centrifugar las células, se aspira el sobrenadante y volver a suspender las células en medio fresco y precalentado durante 30 minutos. Lavar las células en PBS y luego usar para experimentos de rodadura (véase Figura 1B para una imagen representativa de la tinción con CFSE células HL-60 en la superficie P-sel-revestido).

Nota: tinción CFSE es opcional, y se presenta aquí para demostrar el fenómeno de rodadura en el canal de microfluidos. Análisis de parámetros de rodadura presentados en este manuscrito se realizó en células no teñidas utilizando imágenes de campo claro estándar.

2. Células endoteliales microvasculares de pulmón (LMVECs)
   1. Coat 100 mm placas de Petri con solución de gelatina al 0,1% (v / v en PBS) y se incuba a 37 ° C durante al menos 30 min.
   2. LMVECs Cultura en 100 mm placas de Petri recubiertas con gelatina en medio completo de crecimiento endotelial (medio basal endotelial-2 (EBM-2)), suplementado con un kit específico suplemento de crecimiento, ver REACTIVOS). Cambie los medios cada dos células sub-cultura día y al llegar a un 80-90% de confluencia.
   3. Por sub-cultura, lavar las células con PBS y luego separar las células con 4 ml de 1x Tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C y neutralizar en un volumen igual de completos EBM-2 medios de comunicación. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugE (400 xg, 5 min). Después de la centrifugación, se resuspende el sedimento en 1 ml de medios completos endoteliales y contar las células con un hemocitómetro. No se exceda en el paso de las células, ya que esto afecta a su morfología y función del uso de sólo las células bajo el paso 7 para todos los experimentos.

3. Ovario de hámster chino-P-selectina (CHO-P) Células
   1. Células CHO-P, los cuales son células CHO transfectadas establemente para expresar P-sel humana, fueron proporcionados por los colaboradores (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) ^11,12.
   2. Cultura células CHO-P en T175 cm ² frascos de 25 ml de F-12 medios de comunicación.
   3. Para los pases, lavar las células con 10 ml de PBS durante 4-5 seg y luego trypsinize en 10 ml de 1x Tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C, seguido de neutralización en medios completos.
   4. Centrifugar la suspensión celular (400 xg, 5 min), aspirar cuidadosamente el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio completo y el recuento de las células conun hemocitómetro.

2. Funcionamiento del sistema de microfluidos integrado Multi-así placa

1. Asegúrese de que todo el equipo está conectado correctamente y encienda los diferentes módulos: ordenador, controlador, microscopio invertido, y de la cámara CCD.
2. Abra el software de imagen, asegúrese de que el módulo de placas de pocillos múltiples y el módulo de imagen están debidamente presentados en la pantalla.
3. Conectar los tubos a la trampa de vapor (conectado al controlador) y también se conectan a la interfaz de presión.
4. Coloque la placa de múltiples pocillos en la placa de calefacción / adaptador. Añadir los reactivos a los pocillos (descritos a continuación) y adjuntar interfaz en la parte superior de la placa. Coloque la placa para la imagen en el escenario automatizado.
5. La interfaz se conecta a la parte superior de la placa y se aplica una presión neumática desde el controlador a la parte superior de los pozos, la conducción del fluido a través de los canales de microfluidos en la tasa de flujo definido, fácilmente controlado utilizando la placa de múltiples pocillospantalla del módulo en el modo Manual.
6. Reactivos en el canal de flujo a través de un área de observación, situada entre los pozos. Dimensiones del canal de microfluidos son 350 m de ancho x 70 m de altura. La longitud del canal lineal es 1 mm y la parte inferior de los canales comprende un vidrio cubreobjetos 180 micras, que es compatible con campo claro, de fase, de fluorescencia y microscopía confocal.
7. Adquirir vídeos con una cámara CCD (adquisición arroyo, 11 cuadros / seg) y analizar a través de software compatible.

3. Recubrimiento de canales de microfluidos con un sustrato de proteína o una monocapa de células

1. Revestimiento canal de microfluidos con fibronectina o P-/E-selectin
   1. Preparar 1 ml de 20 mg solución de fibronectina ml / en PBS. Alter volumen basado en el número de canales a recubrir (utilizar 25-50 l de fibronectina por canal).
   2. Añadir 25-50 l de solución de fibronectina a cada entrada bien. Aplicar fuerza de corte de 2 dyn / cm ²durante 5 min para perfundir el canal. Tenga en cuenta el talón de líquido que aparece en la salida también. Se incuba durante 30-45 minutos a temperatura ambiente
   3. Aspirar la solución de los pozos (no aspirar directamente desde el círculo central que alimenta el canal) ^1,13. Añadir 200-500 l de PBS en el tomacorriente bien y lavar con PBS canal mediante la aplicación de flujo de cizallamiento de 2 dyn / cm ² durante 5 min. El canal está ahora revestido adecuadamente con fibronectina y listo para ser utilizado.
   4. Para recubrir con P-o E-sel, preparar una solución de 5 mg / ml de la proteína recombinante humana deseada en PBS, y revista las canales como los descritos anteriormente, con 1 hora de incubación a 37 ° C para permitir revestimiento de la superficie.
2. Creación de CHO-P o LMVEC monocapa en el interior del canal de microfluidos
   1. Trypsinize suavemente las células de placas de cultivo durante 3 min, se inactiva utilizando un volumen de 2 veces de medios completos y centrifugar (5 min a 400 xg). Resuspender las células con 10 ml de medio completo y centrifugar (5 min a 400 xg) again.
   2. Contar las células para determinar la concentración de células en la suspensión. Para asegurar la formación de una monocapa confluente LMVEC el interior del canal, llevar la concentración de células 15-20 millones de células / ml. Para una monocapa confluente de células CHO-P, utilizar 50 hasta 60 millones de células / ml. Utilice 25-50 l de suspensión de células para cada canal - determinar el número de células inicial utilizado para el experimento en consecuencia.
   3. Añadir 25-50 l de suspensión celular en la concentración apropiada a la entrada así. Coloque la placa en la platina del microscopio e introducir las células en el canal (2 dyn / cm ²⁾ hasta que se observan células en la pantalla de llenar los canales enteras, y luego se detiene el flujo.
   4. Llene las dos salida y la entrada con 200 l de cualquiera LMVEC completo o medio CHO. Deje que las células se asientan y se adhieren durante 3 horas en la incubadora (37 ° C, 5% de CO _2).
   5. Después de la incubación de 3 horas, lavar el canal con plena medios de comunicación (2 dyn / cm ^2, 10-15 min) para eliminar desapegadocélulas. Las células deben aparecer ahora completamente confluentes y el canal ya está listo para su uso. Dependiendo de la densidad inicial de la siembra de células, 2-3 horas adicionales de tiempo de establecimiento puede ser necesaria para asegurar una cobertura completa de la superficie con las células.

4. LMVEC activación Pro-inflamatorios y anticuerpo bloqueante de P-/E-selectin

1. Preparar una solución de TNF-α (10 ng / ml) en LMVEC medio basal.
2. Para inducir la activación inflamatoria de LMVEC en los canales, añadir 100 l de la solución de TNF-α a la entrada y así introducir la solución en el canal mediante la aplicación de flujo de cizallamiento de 2 dyn / cm ² durante 5 min. Para los canales de control (EC no activado), añadir 100 l de LMVEC medio basal a la entrada y así introducir en el canal (2 dyn / cm ² durante 5 min). Canal está ahora listo para un ensayo de rodadura.
3. Para bloquear el P-sel y E-sel en LMVECs y células CHO-P, la introducción de neutralizar P-sel (AK4 clon, 5 g / ml en basal de medios) o E-sel (P2H3 clon, 5 g / ml en medio basal) anticuerpos en el canal y se incuban durante 1 hora a 37 ° C. A continuación, lavar canales con medio basal (2 dyn / cm ² durante 5 min). Canales ya están listos para un ensayo de rodadura.

5. HL-60 Ensayo de balanceo en Sustrato / Teléfonos monocapa-Coated canales de microfluidos

1. Examine cuidadosamente los canales bajo el microscopio para confirmar que los canales están revestidos adecuadamente (en el caso de revestimiento con células, se debe observar una monocapa celular confluente totalmente).
2. Para preparar HL-60 suspensión de células para los experimentos rodantes, centrífuga HL-60 suspensión de células (5 min a 400 xg) y lavar una vez con medio basal. Contar las células y resuspender en IMDM (medios basales, que contienen Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +)} para crear una suspensión de células HL-60 con 5 millones de células / ml. Utilice 25-50 l de suspensión de células para cada canal para realizar el ensayo de rodadura.
3. Añadir 25-50 l de la suspe celularnsion a una toma de corriente, así, el lugar dentro de la placa de soporte de la placa a temperatura controlada (37 º C), y meterlo en la platina del microscopio. A continuación, introducir células en el canal mediante la aplicación de fuerza de corte de 2 dyn / cm ² (células deben ser observados dentro de 10 a 15 segundos que fluye desde la salida a la entrada).
4. Para examinar la respuesta de laminación en función de la tensión de corte, reducir la cizalladura de 0,25 dinas / cm ² y adquirir vídeos 20-30 seg (mediante la función de "adquisición stream") en cada uno de cizallamiento deseada (aumentar la cizalladura gradualmente desde 0,25 hasta 5 dyn / cm ^2. También es posible utilizar tijeras superiores).
5. Adquirir vídeos con una cámara CCD (adquisición arroyo, 11 cuadros / seg) y analizar ondulantes caminos y rodantes velocidades a través del software compatible.

6. La citometría de flujo para detectar la expresión de moléculas de superficie

1. Después de tripsinización, preparar una suspensión de células (de 1-2 x 10 ⁵ células / muestra) de tipo celular deseado (HL-60, CHO-P o LMVECs) en PBS (- / -), suplementado con 2% de FBS. Lavar las células dos veces y se ajusta el volumen de la muestra de 50 l (utilizando el mismo tampón).
2. Incubar cada muestra con el fluoróforo conjugado Ab deseada (véase el cuadro adjunto para obtener información detallada) a 4 ° C durante 20 minutos (cubrir con papel de aluminio).
3. Lavar las células dos veces (mismo tampón) y llevar el volumen final de la suspensión de células teñidas a 200 l. Analizar las muestras usando un citómetro de flujo para detectar la expresión de moléculas de superficie.

Resultados

HL-60 células rodar sobre superficies P-y E-selectina, pero no en la fibronectina

HL-60 células se consideran "rodillos" estándar de oro ya que expresan una variedad de ligandos mensajeras, incluyendo los ligandos de rodadura P-sel de glicoproteína ligando-1 (PSGL-1) y Sialyl-Lewis X (SLeX) ^5,14 (Figura 1A ). Las proteínas de superficie PSGL-1 actúa como un andamio para el tetra-sacárido SLeX, que median la interacción específica con P-y E-sel, que...

Discusión

Uno de los principales retos en la traducción exitosa de la terapia basada en células exógena es la incapacidad de entregar eficientemente las células a los sitios de lesión y la inflamación con una alta eficiencia de injerto ^3. Laminación celular representa un paso crítico en el proceso de homing de células, facilitando la desaceleración de las células en las paredes de los vasos sanguíneos, llevando eventualmente a su firme adhesión y la transmigración a través del endotelio hacia el tejido <...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)	Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 Cells	ATCC	CCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal Medium	Lonza	CC-3156
EBM-2 Media	Lonza	CC-3156
Endothelial Basal Medium Supplements	Lonza	CC-4147
EGM-2 MV SingleQuots	Lonza	CC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x	Gibco	12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)	Gibco	11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S)	Gibco	15140
L-Glutamine (L/G) 200 mM	Gibco	25030
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	Sa550
Petri Dishes	BD Falcon	BD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)	MedSupply Partners	TC1500
T75 Flasks	BD Falcon	353136
Gelatin Solution (2%)	Sigma	G1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)	Sigma	D8537
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62E	R&D Systems	BBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA21
Anti-hP-Selectin	R&D Systems	BBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype Control	BD Bioscience	555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18	Santa Cruz	SC70545
FITC Conjugated	Santa Cruz	SC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control	Santa Cruz	SC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1	BD Pharmingen	556055
PE Mouse IgG1 k Isotype Control	BD Pharmingen	550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)	Santa Cruz	SC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3	Millipore	MAB2150
Mouse IgG1 Isotype Control	Santa Cruz	SC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alpha	PeproTech	300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry	Invitrogen	C34554
Human P-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	724-ES-100
Fibronectin Human, Plasma	Invitrogen	33016-015
Equipment
Bioflux 1000	Fluxion Biosciences	Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well plates	Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD Bioscience	CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-S	Nikon
CoolSnap HQ2 CCD camera	Photometrics