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要約

この研究は、有意に生理学的に関連するせん断流の下で細胞ローリング研究のスループットを向上させる、マルチウェルプレート、マイクロ流体システムを用いる。カスケードおよび患者における細胞の外因集団の全身送達後の細胞のホーミングの重要性をホーミング多段階の細胞における細胞ローリングの重要性を考えると、このシステムは、細胞ベースの治療を改善するためのスクリーニングプラットフォームとしての可能性を提供しています。

要約

細胞ベースの治療のための主要な課題は、全身静脈内または動脈内注入後、目的の組織への高い効率での生存細胞を大量に標的とすることができないことである。従って、細胞ホーミングを増大は、現在細胞治療を改善するための戦略として検討されている。血管内皮上の細胞ローリングは、細胞ホーミングの過程における重要なステップであり、平行平板流動チャンバ（PPFC）を用いてインビトロで調べることができる。しかしながら、これは、コントロール不良のフロー条件で、非常に退屈な、低スループットアッセイである。代わりに、我々は正確に制御され、生理学的に関連するせん断流1,2の下で、より高いスループットで携帯圧延性質の研究が可能になり、マルチウェルプレートのマイクロ流体システムを使用していました。本論文では、HL-60の転がり特性（人間の前骨髄球性白血病）、P-およびE-セレクチンでコーティングされた表面上での細胞だけでなく、細胞の単層でコーティングされた表面にはreadilする方法を示しYは、検討した。良好な炎症状態をシミュレートするために、マイクロ流体チャネルの表面は、次いで、有意に動的条件下でのHL-60細胞との相互作用を増大させる、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）で活性化した内皮細胞（EC）でコーティングした。強化されたスループットと、このような速度を圧延パス圧延などのパラメータの迅速な分析を可能にする統合されたマルチパラメータ解析ソフトウェアプラットフォームは、 インビトロの細胞ローリングの特性を評価するための重要な利点である。細胞ローリングおよびホーミングに影響を与えるように設計された工学的アプローチの迅速かつ正確な分析を可能にし、このプラットフォームは、あらかじめ、外因性細胞ベースの治療を助けるかもしれない。

概要

細胞ベースの治療の成功臨床翻訳の主要な課題の一つは、非効率的な配信や希望のサイト3,4に全身注入された細胞の標的である。従って、細胞ホーミングを改善するためのアプローチのための一定の探索があり、具体的には細胞療法を改善するための戦略として、ローリング細胞。血管に細胞ローリングは、古典的に疾患部位5に補充される白血球のために定義され、細胞のホーミングカスケードにおける重要なステップである。このステップは、すなわち 、内皮セレクチン間の特異的相互作用によって支配されるP-およびE-セレクチン（P-およびE-SEL）、及びそれらのカウンターリガンド白血球5,6の表面に。理解と細胞のホーミング、具体的には、圧延工程の効率改善は、細胞ベースの治療を改善するための新しいプラットフォームのための探求で非常に重要である。今日まで、この2つの平らなプラットフォームを含む、パラレルプレートフローチャンバー（PPFCs）を使用することによって達成されている細胞懸濁液をシリンジポンプ7,8、9を用いて灌流されたプレートを介して上部に位置する流入および流出ポートと、それらの間にガスケットを有するエス。底板の表面は、関連する細胞単層/基材で被覆することができ、せん断流下灌流細胞と表面との間の相互作用は、その後7を検討している。しかし、PPFCは気泡形成、漏洩、および主要な欠点​​を提示するコントロール不良の流れと、低スループット、試薬がかかり、かなり面倒な方法です。

従来のPPFCの代替技術は、低消費1,10試薬と細胞アッセイ（PPFCsより最大10倍高い）正確な、コンピュータ制御されたせん断流の下で、より高いスループット性能を可能にする、マルチウェルプレート、マイクロ流体システムである。細胞ローリング実験は、マイクロ流体チャネル内で実行されている細胞単層または操作された基材で被覆することが可能とUSIをイメージngのローリング特性を有する顕微鏡は、容易に適切なソフトウェアを用いて分析した。本研究では、異なる表面上のヒト前骨髄球性白血病（HL-60）細胞のローリングの特性を研究することによって、このマルチウェルプレート、マイクロ流体システムの能力を実証する。 HL-60 P-およびE-selの様基板上の、ならびに異なるローリング受容体を発現する細胞単層上を転動を分析した。また、ブロッキング抗体（Ab）は、それらの表面上のHL-60の回転運動を媒介する特定のセレクチンの直接的な関与を実証した。ローリング実験は、圧延速度、ローリング細胞の数、および圧延パス特性などの主要圧延パラメータの効率的な解析を可能にする、最小限の試薬/細胞消費で、安定したせん断流の下で、増大したスループットを用いて行った。

プロトコル

1。細胞培養

  1. ヒト前骨髄球性白血病（HL-60）細胞
    1. 75センチメートル培養HL-60細胞を20％（v / v）ウシ胎児血清（FBS）、1％（v / v）のL-グルタミンおよび1を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、15 mlの2フラスコ％（v / v）のペニシリン - ストレプトマイシン。
    2. 細胞懸濁液体積の半分を吸引し、完全IMDM培地に置き換えて3日毎に培地を変更します。
    3. カルボキシフルオレセインジアセテートは、スクシンイミジルエステル（CFSE）染色、遠心HL-60細胞懸濁液（400×gで、5分間）、（予め温めたPBSで調製）1μMCFSE溶液中で再懸濁し、37℃で15分間インキュベートするその後、30分間、新鮮な温めておいた培地中の遠心分離機細胞、吸引上清と細胞を再懸濁。 PBS中で細胞を洗浄した後、（P-SELでコーティングされた表面にCFSE染色したHL-60細胞の代表的な画像については、図1（b）参照 ）、圧延実験に使用しています。

注：CFSE染色はオプションであり、マイクロ流体チャネル内のローリング現象を説明するためにここに提示されている。本稿で提示圧延パラメータの分析は、標準的な明視野イメージングを用いて染色されていない細胞で行った。

  1. 肺微小血管内皮細胞（LMVECs）
    1. コー​​ト100ミリメートルのペトリ皿を0.1％ゼラチン溶液（PBS中のv / v）を有する少なくとも30分間37℃でインキュベートする。
    2. 特定の成長サプリメントキットを補充した完全内皮増殖培地中のゼラチンコート100ミリメートルペトリ皿（内皮基本培地-2（EBM-2））が、試薬を参照してください上の文化LMVECs）。メディアの80〜90％のコンフルエンスに達したとき、一日おきにサブ培養細胞を変更します。
    3. 継代培養のために、PBSで細胞を洗浄した後、細胞を1×デタッチトリプシン-EDTA 4mlで3分間、37℃で、完全EBM-2培地の等量を中和。 15mlチューブとcentrifugに細胞懸濁液を転送する電子メール（400×gで、5分間）。遠心分離後、完全な内皮培地1ml中にペレットを再懸濁し、血球計算板を用いて細胞を数える。これはすべての実験のための通路7でのみ細胞、それらの形態や機能、使用に影響を与えるように、オーバー継代細胞をしないでください。
  1. チャイニーズハムスター卵巣-P-セレクチン（P-CHO）細胞
    1. 安定的にヒトP-SELを発現するようにトランスフェクトしたCHO細胞であるCHO-P細胞は、共同研究者（ベスイスラエルメディカルセンター、ハーバード大学医学部）11,12によって提供された。
    2. T175のCMにおける培養したCHO-P細胞のF-12培地25ml中2のフラスコ。
    3. 継代のために、4〜5秒間10mlのPBSで細胞を洗浄した後、完全なメディアで中和し、37℃で3分間1Xトリプシン-EDTA 10mlにトリプシン処理。
    4. 細胞懸濁液を遠心分離（400×gで、5分間）、注意深く上清を吸引完全培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁して細胞を数える血球計数器。

2。統合されたマルチウェルプレートのマイクロ流体システムの動作

  1. すべての機器が正しく接続されていることを確認し、異なるモジュールをオンにする：コンピュータ、コントローラ、倒立顕微鏡、CCDカメラ。
  2. イメージングソフトウェアを開き、マルチウェルプレートモジュール及び撮像モジュールが正しく画面に表示されていることを確認してください。
  3. （コントローラに接続されている）、蒸気トラップにチューブを接続し、また、圧力のインターフェイスに接続します。
  4. プレートヒーター/アダプタでマルチウェルプレートを置きます。ウェルに試薬を追加します（後述）、プレートの上にインターフェイスを接続します。自動化されたステージ上で画像化のためにプレートを置きます。
  5. インタフェースは、プレートの上面に取り付けられ、定義された流速でマイクロ流体チャネルを通して流体を駆動する、ウェルの上部に、コントローラからの空気圧を印加し、容易にマルチウェルプレートを使用して制御マニュアルモードでモジュール画面。
  6. 井戸の間に位置し、観察領域、全体のチャネルフローの試薬。マイクロ流体チャネル寸法は70μmで高さ350μm幅Xです。線形チャネルの長さは1mmであり、チャネルの底部は、明視野、位相、蛍光および共焦点顕微鏡と互換性のある180μmのカバースリップガラスを含む。
  7. CCDカメラ（ストリーム取得、11フレーム/秒）を使用してビデオを取得し、互換性のあるソフトウェアを使用して分析します。

3。タンパク質基質や細胞単層を持つマイクロ流体チャネルのコーティング

  1. フィブロネクチンまたはP-/E-selectinとマイクロ流体チャネルをコーティング
    1. PBS中20μg/ mlのフィブロネクチン溶液1mlを準備します。コー​​ティングされるチャンネル数（チャネルあたりフィブロネクチンの25〜50μlを使用する）に基づいてボリュームを変更します。
    2. 各ウェル入口にフィブロネクチン溶液を25〜50μlを加える。 2 DYN / cm 2のせん断力を加え、5分のチャネルを灌流するため。液体がよく口に登場するのビードに注意してください。室温で30〜45分間インキュベート
    3. 1,13（チャネルを供給する中央のサークルから直接吸引していない）をウェルから溶液を吸引除去する。コンセントウェルにPBSを200〜500μLを加え、5分間2ダイン/ cm 2のせん断流を適用することにより、PBSでチャンネルを洗う。チャネルが正しくフィブロネクチンおよび使用可能な状態で被覆される。
    4. 表面コーティングを可能にするために、37℃で1時間インキュベーションして、上記のようにP-またはE-selの、PBS中で所望のヒト組換えタンパク質を5μg/ mlの溶液を調製し、コートチャンネルをコートする。
  2. マイクロ流体チャネルの内部CHO-PまたはLMVEC単層の作成
    1. 穏やかに完全培地および遠心分離機の2倍容量（400×gで5分間）を用いてクエンチし、3分間培養皿から細胞をトリプシン処理。フルメディアや遠心分離機の10ミリリットル（400×gで5分）で細胞を再懸濁agaiN。
    2. 懸濁液中の細胞濃度を決定するために、細胞を計数。チャネル内部のLMVECコンフルエントな単層の形成を確実にするために15〜20万細胞/ mlに細胞濃度をもたらす。コンフルエントCHO-P細胞単層の場合は、50から60000000個/ mlを使用しています。各チャンネルごとに細胞懸濁液の25〜50μlを使用する - それに応じて実験に用いた最初の細胞数を決定する。
    3. よく入口に適当な濃度での細胞懸濁液の25〜50を添加する。顕微鏡ステージ上でプレートを置き、細胞が全体のチャンネルを埋め、画面上で観察されるまで、チャネル（2 DYN / cm 2）の中に細胞を導入してから、流れを止める。
    4. フルLMVECまたはCHO培地のどちらか200μlの出口及び入口の両方を記入してください。細胞が沈降しましょうし、インキュベーター（37℃、5％CO 2）で3時間付着する。
    5. 3時間のインキュベーション後、付着していない削除する完全なメディア（2 DYN / cm 2で、10〜15分）でチャンネルを洗う細胞。細胞は完全にコンフルエント表示され、チャネルが使用できるようになりました。初期細胞播種密度に依存して、整定時間の追加の2〜3時間、細胞と表面の完全な被覆を確実にするために必要とされてもよい。

4。 LMVECは、炎症誘発性活性化とP-/E-selectinの抗体ブロッキング

  1. LMVEC基礎培地中のTNF-α溶液（10 ng / mlの）を準備します。
  2. チャンネル内LMVECの炎症活性化を誘導よく入口に、TNF-α溶液100μlを加え、5分間2 DYN / cm 2のせん断流を適用することにより、チャネル内にソリューションを導入することができる。制御チャネル（非活性ECS）の場合は、よく入口にLMVEC基礎培地を100μlを加え、チャンネル（5分間2 DYN / cm 2）の中に導入する。チャネルは現在、ローリングアッセイの準備ができている。
  3. P-SELとLMVECs及びCHO-P細胞に対するE-SELをブロックするには、P-SEL（クローンAK4、BAにおける5μg/ mlの中和紹介SALメディア）またはE-SEL（クローンP2H3、基礎培地中の5μg/ ml）をチャネルに抗体および37℃で1時間インキュベート次に、（5分間2ダイン/ cm 2）を基本培地でチャンネルを洗う。チャンネルは現在、ローリングアッセイの準備ができている。

5。基板/細胞単層被覆マイクロ流体チャネル上で、HL-60ローリングアッセイ

  1. 注意深く（細胞によるコーティングの場合には、完全にコンフルエントな細胞単層が観察されるべきである）チャネルが適切に被覆されていることを確認するために顕微鏡下でのチャネルを調べる。
  2. ローリング実験は、遠心機HL-60細胞懸濁液（400×gで5分）HL-60細胞懸濁液を調製し、基本培地で一回洗浄する。 IMDM中の細胞を再懸濁をカウント（基本培地のCa 2 +およびMg 2 +を含有する）3万細胞/ mlのHL-60細胞懸濁液を作成する。ローリングアッセイを行うために、チャネルごとに細胞懸濁液を25〜50μlを使用する。
  3. セルsuspeの25〜50μlを添加nsionは、顕微鏡ステージ上に温度制御されたプレートホルダ（37°C）と場所の内部で、ウェル場所プレート出口する。次に、（細胞が入口にコンセントから流れる10月15日秒以内に観察されるべきである）2 DYN / cm 2のせん断力を加えることにより、チャネルに細胞を導入する。
  4. せん断応力の関数としてローリング応答を調べるために、（5 DYNまで0.25から徐々に剪断力を高めるDYN / cm 2で0.25に剪断力を減少させ、各々の所望の剪断（「ストリーム取得」機能を使用して）、20〜30秒のビデオを取得する/ cm 2であることがより高い剪断を使用することも可能である）。
  5. CCDカメラ（ストリーム取得、11フレーム/秒）を使用してビデオを取得し、互換性のあるソフトウェアを使用してパスをロール圧延速度を分析する。

6。表面分子の発現を検出するために、フローサイトメトリー

  1. トリプシン処理後、所望の細胞型（HL-60、CHO-（1-2×10 5細胞/サンプルを使用して）細胞懸濁液を調製PBS中のP又はLMVECs）（ - / - ）、2％のFBSを補充した。細胞を2回洗浄し、50μL（同じバッファを使用）にサンプル量を持って来る。
  2. 20分間、4℃で所望の蛍光団結合抗体（詳細については、添付の表を参照）（アルミホイルでカバー）で各サンプルをインキュベートする。
  3. 細胞を2回洗浄する（同一緩衝液）200μlに染色された細胞懸濁液の最終体積をもたらす。表面分子の発現を検出するためにフローサイトメーターを用いてサンプルを分析する。

結果

HL-60細胞は、フィブロネクチン上でP-およびE-セレクチンの表面上にロールではなく、

彼らはローリングリガンド、P-SEL糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）およびシアリル-ルイスX（のSLeX）を含むホーミングリガンドの様々 5,14（ 図1（a）を表現するように、HL-60細胞は、ゴールドスタンダード"ローラー"と考えられている）。との特異的な相互作用?...

ディスカッション

外因性の細胞ベースの治療の成功翻訳の主要な課題の一つは、効率的に、高い生着効率3で ​​傷害や炎症部位 ​​に細胞を送達することができないことである。細胞ローリングは、最終的に組織5への内皮を通して、強固な接着および遊出を導く血管壁上のセルの減速を促進する、細胞のホーミングの過程における重要なステップを表している。候補セルタイプの圧延プロ?...

開示事項

著者らは、利害の競合を宣言していません。

謝辞

CHO-P細胞は博士バーバラ·フューリー（ベスイスラエルメディカルセンター、ハーバード大学医学部）からの親切な贈り物だった。この作品は、この作品にもJMKにMovember - 前立腺がん財団チャレンジ賞によって部分的にサポートされていましたJMKに健康グラントHL095722の国立研究所によってサポートされていました

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Human Lung Microvascular Endothelial CellsLonzaCC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 CellsATCCCCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
Endothelial Basal Medium SupplementsLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1xGibco12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)Gibco11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S)Gibco15140
L-Glutamine (L/G) 200 mMGibco25030
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
Petri DishesBD FalconBD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)MedSupply PartnersTC1500
T75 FlasksBD Falcon353136
Gelatin Solution (2%)SigmaG1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)SigmaD8537
Trypsin-EDTA Solution (10x)SigmaT4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62ER&D SystemsBBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1R&D SystemsBBA21
Anti-hP-SelectinR&D SystemsBBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1R&D SystemsBBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype ControlBD Bioscience555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18Santa CruzSC70545
FITC ConjugatedSanta CruzSC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype ControlSanta CruzSC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1BD Pharmingen556055
PE Mouse IgG1 k Isotype ControlBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3MilliporeMAB2150
Mouse IgG1 Isotype ControlSanta CruzSC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alphaPeproTech300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow CytometryInvitrogenC34554
Human P-selectin-FC recombinant proteinR&D Systems137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant proteinR&D Systems724-ES-100
Fibronectin Human, PlasmaInvitrogen33016-015
Equipment
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well platesFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow CytometerBD BioscienceCFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2 CCD cameraPhotometrics

参考文献

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80 HL 60 TNF P E

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