Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform

Resumen

Deformación mecánica rápida de las células se ha convertido en un método prometedor, libre de vectores para el suministro intracelular de macromoléculas y los nanomateriales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre cómo utilizar el sistema para una amplia gama de aplicaciones.

Resumen

Deformación mecánica rápida de las células se ha convertido en un método prometedor, libre de vectores para el suministro intracelular de macromoléculas y los nanomateriales. Esta tecnología ha demostrado su potencial en el tratamiento de las solicitudes previamente difíciles, como son, la entrega de las células primarias inmunes, la reprogramación celular, nanotubos de carbono, y la entrega de puntos cuánticos. Esta plataforma de microfluidos libre de vectores se basa en la rotura mecánica de la membrana celular para facilitar la entrega citosólica del material objetivo. En este documento, se describe el método detallado de uso de estos dispositivos de microfluidos, incluyendo, conjunto de dispositivo, preparación de células, y la operación del sistema. Este enfoque requiere la entrega de un breve optimización del tipo de dispositivo y condiciones de funcionamiento de las aplicaciones antes publicados. Las instrucciones que se proporcionan son generalizables a la mayoría de tipos de células y materiales de entrega ya que este sistema no requiere tampones especializados o pasos modificación química / de conjugación. Este trabajo también proporcionans de recomendaciones sobre cómo mejorar el rendimiento del dispositivo y localizar averías problemas potenciales relacionados con la obstrucción, la eficiencia de entrega de baja, y la viabilidad celular.

Introducción

La entrega de macromoléculas a la citoplasma de la célula es un paso crítico en aplicaciones terapéuticas y de investigación. Nanopartículas mediada por la entrega, por ejemplo, ha demostrado su potencial en la terapia génica ^{de 1,2,} mientras que la entrega de proteínas es un medio prometedor para afectar la función celular en tanto clínicos y de laboratorio ^{3 4} ajustes. Otros materiales, tales como fármacos de moléculas pequeñas, puntos cuánticos, o nanopartículas de oro, son de interés en aplicaciones que van desde la terapéutica del cáncer ^5,6 a ^7,8 etiquetado intracelular, y una sola molécula de seguimiento ^9.

La membrana celular es en gran medida impermeable a macromoléculas. Muchas de las técnicas existentes utilizan nanopartículas poliméricas, liposomas ^{10,11 12,} o modificaciones químicas ¹³ para facilitar la ruptura de la membrana o la entrega de endocitosis. En estos métodos, la eficiencia en la entrega y la viabilidad celular son a menudo depende de la estructura de the molécula diana y el tipo de célula. Estos métodos pueden ser eficaces en la entrega de los materiales estructuralmente uniformes, tales como ácidos nucleicos, pero a menudo son poco adecuado para la entrega de más estructuralmente diversos materiales, tales como las proteínas y los nanomateriales ^{14,15 7.} Por otra parte, el mecanismo de interrupción endosoma que la mayoría de estos métodos se basan en es a menudo ineficaz, por lo tanto, dejando mucho material atrapado en estructuras vesiculares ^16. Por último, los métodos que a menudo se desarrollan para su uso con las líneas celulares establecidas no se traducen bien a las células primarias.

Métodos poración de membrana, tales como la electroporación ^17,18 y sonoporación ^19, son una alternativa atractiva en algunas aplicaciones, sin embargo, se sabe que causan la viabilidad celular baja y puede ser limitado por la carga del material de entrega esperados.

Deformación mecánica rápida de las células, un enfoque de microfluidos para la entrega, tiene recientemente demonstrATED sus ventajas sobre las técnicas actuales en el contexto de la reprogramación celular ²⁰ y la entrega nanomaterial ^21. Este método se basa en la rotura mecánica o la membrana celular para facilitar la entrega citosólica de los materiales presentes en el tampón circundante. El sistema ha demostrado que permite el potencial para desafiar previamente tipos de células (por ejemplo, células inmunes primarias y las células madre) y materiales (por ejemplo, anticuerpos y nanotubos de carbono). En este documento, se describe el procedimiento general para utilizar estos dispositivos para la entrega intracelular de macromoléculas diana. El procedimiento es generalizable a la mayoría de tipos de células y materiales de entrega, sin embargo, se recomienda que uno Realizar una pequeña optimización de las condiciones, como se detalla en nuestras pautas de diseño de informes anteriores ^20, para cualquier aplicación que no reportados previamente. Hasta la fecha, el sistema ha sido utilizado con éxito para la entrega de ARN, ADN, las nanopartículas de oro, puntos cuánticos, nanotubos de carbono, proteínass, y polímeros de dextrano ^20,21.

Protocolo

1. Almacenamiento

1. Guarde los depósitos, soportes, juntas tóricas y los dispositivos de microfluidos en etanol al 70%. Use un recipiente (por ejemplo, frasco o vaso de precipitados) que tiene una tapa para evitar la evaporación y la contaminación por partículas de polvo o fuera. Coloque los dispositivos en un contenedor (1), embalses y juntas tóricas en un segundo recipiente (2), y los titulares en el tercer (3).

Nota: El uso de etanol al 70% para el almacenamiento es para mantener la esterilidad. Si los únicos componentes de la solución son el etanol y el agua (es decir, sin agentes desnaturalizantes), todos los componentes del sistema deben ser totalmente compatibles y no se degradarán con el tiempo.

2. Cambie solución de etanol en recipientes (2) y (3) antes de cada uso para evitar la contaminación cruzada a través de experimentos y reducir al mínimo la presencia de partículas no deseadas que pueden causar la obstrucción.

2. Preparación experimental

1. Ponga sus recipientes (2) y (3) en un baño de ultrasonido for 5-10 min antes de cada uso. Esto ayuda a eliminar las partículas contaminantes de los experimentos anteriores.
2. Espacio de trabajo limpio en cabinas de seguridad con una solución de etanol al 70%.
3. Rocíe todos los materiales (3 contenedores y pinzas) con una solución de etanol al 70% antes de colocarlos en el interior de la cabina de bioseguridad.

3. Montaje

1. Deposite 2-3 toallitas bajo pelusa en el área de trabajo.
2. Eliminar depósitos de plástico de su contenedor con unas pinzas y ponerlos en las toallitas para facilitar la evaporación de la solución de etanol a partir de superficies interiores. Golpear suavemente los depósitos en la superficie o soplar el aire a través de ellos para facilitar la eliminación de la solución de etanol.
3. Inserte las juntas tóricas en su ranura correspondiente de los depósitos.
4. Retire el soporte y las fichas de los contenedores respectivos y permitir que el etanol se evapore (~ 1-2 min).
5. Use pinzas para colocar el chip boca arriba deseada (es decir, los agujeros de acceso de seguridad) en el soporte. Levante el soportecon el chip a nivel de los ojos para asegurarse de que el chip está plana en el soporte y ajuste si es necesario con las pinzas. IMPORTANTE: Si el dispositivo no encaja correctamente en su soporte, existe el riesgo de que se rompa durante las etapas posteriores.
6. Luego, coloque suavemente los embalses en el soporte y alinearlos con los clips. Tenga cuidado de que las juntas tóricas no se salgan de sus ranuras durante este proceso.
7. Presione suavemente hacia abajo en los embalses hasta que encajen en su lugar. Asegúrese de que ambos lados de los embalses sean seguros y que el chip parece estar en la posición correcta.

4. Preparación de células

1. Para células adherentes (líneas primarias o establecidas: células de la placa) 1-2 días antes del experimento de manera que sean no más de 80% de confluencia en el día del experimento.
2. Coloque las células en suspensión (en PBS o medio relevante) y aspirar a una concentración de funcionamiento de 1,0 x 10 ⁶ células / ml a 1,0 x 10 ⁷ cells / ml. NOTA: No se han observado cambios significativos en el rendimiento de la entrega debido a la concentración de células.
3. Mezclar las células y el material de entrega deseado en un tubo separado para obtener la concentración de material deseado para el experimento. IMPORTANTE: Debido a que el método de entrega descrito se basa en la difusión para facilitar la entrega, una concentración de material de más alto producirá la entrega superior. Si es posible, se recomienda utilizar una solución 1 M de material deseado para los ensayos iniciales. Esta concentración puede entonces ser titulada en futuros experimentos, según sea necesario. La concentración más baja reportada utilizado con este dispositivo es 10 nM ^21.

5. Operación

1. Mezcla de pipetas de células y el material de entrega en un depósito (diseño actual tiene una capacidad máxima de 150 l). NOTA: La mayoría de los diseños de dispositivos son totalmente reversibles, por tanto, la dirección del flujo a través de los canales, no importa. Las muestras pueden ser cargados en cualquiera de los dos depósitos.
2. Conecte el tubo de presión para el depósito lleno y apriete la tuerca para garantizar el cierre (apretado el dedo suele ser suficiente).
3. Ajustar la presión al nivel deseado en el regulador. Esto controla la velocidad a la que las células viajan a través del dispositivo. Tenga en cuenta que el flujo de células no se inicia hasta que se pulse el botón.

NOTA: En el trabajo anterior, nitrógeno o aire comprimido han trabajado igualmente bien como gas portador.

4. Elevar dispositivo a nivel de los ojos y orientarla de modo que el líquido en el depósito es fácilmente visible. NOTA: Seguimiento de la columna de líquido para apagar el sistema antes de vaciar el depósito.
5. Pulse el botón para presurizar el depósito y comenzar el flujo de células.
6. Cuando el nivel de líquido es de aproximadamente 2 mm de la parte inferior del depósito, gire rápidamente el regulador a 0 psi para detener el flujo. IMPORTANTE: Si uno no logra detener el flujo antes de vaciar el depósito, se corre el riesgo de expulsar la muestra de la CollectioN depósito. También tenga en cuenta que si la columna de fluido no se está moviendo a un ritmo apreciable, o ha disminuido sustancialmente en relación a su caudal inicial (por ejemplo, 3 veces más lento), el dispositivo montado probablemente obstruido y necesita ser intercambiado. La operación de un dispositivo obstruido puede conducir a una mayor muerte celular.
7. Recoger las células tratadas desde el depósito correspondiente y colocarlos en el tubo de recogida / plato deseado. IMPORTANTE: No diluir las células recogidas en cualquier búfer en esta etapa ya que las células porated continuarán con la captación de material para un máximo de 10 min ^20. Después de esta ventana ha pasado, diluir las células en los medios de comunicación / tampón deseada.
8. Para recoger las células tratadas más o tratar condiciones experimentales alternativos, repita los pasos 5.1 a 5.7, según sea necesario. Recordemos que las fichas son reversibles, por lo tanto, las muestras se pueden montar en cualquiera de los depósitos. Asegúrese de cambiar fichas según sea necesario si se obstruyen. Deseche dispositivos tapados.

6. Desmontaje

1. Desconecte con cuidado los depósitos del titular principal pulsando un lado las armas de clip.
2. Coloca cada pieza en el recipiente de almacenamiento adecuado (que se detallan en la sección 1).
3. Coloque los chips usados ​​en un contenedor separado para su eliminación.

Resultados

La figura 1 contiene un esquema descriptivo del sistema de suministro de microfluidos. Figuras 2a-b ilustran resultados típicos de tratamiento de las células HeLa con diferentes diseños de dispositivos en la presencia de fluorescencia conjugado 3 kDa de dextrano ^20. Si el procedimiento se sigue correctamente, el rendimiento del sistema será sensible al tipo de dispositivo y la velocidad de operación. Por lo tanto, se debe optimizar estas condiciones para una aplicación ...

Discusión

Pueden necesitar ser optimizado en función del tipo de células y material de suministro del sistema se aplica a ciertos aspectos del procedimiento experimental descrito (es decir, factores distintos de diseño de chips y la velocidad de funcionamiento). La discusión que sigue trata sobre algunos de los factores más comunes a tener en cuenta en el diseño de experimentos.

Para mejorar la señal de entrega de compuestos marcados con fluorescencia, se necesita para hacer frente a l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Holder & Plastic reservoir	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A	Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Rings	McMaster	9452K311
Pressure system to operate device	SQZ Biotechnologies	Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath