Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Résumé

Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d'utiliser le système pour une large gamme d'applications.

Résumé

Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Cette technologie a démontré un potentiel dans le traitement des demandes auparavant difficiles, y compris, la livraison de cellules primaires du système immunitaire, la reprogrammation cellulaire, nanotubes de carbone, et la prestation de point quantique. Cette plate-forme microfluidique indemne de vecteurs repose sur une rupture mécanique de la membrane de la cellule pour faciliter la délivrance cytosolique de la matière cible. Nous décrivons ici la méthode détaillée de l'utilisation de ces dispositifs microfluidiques, y compris, le montage du dispositif, de la préparation cellulaire, et le fonctionnement du système. Cette approche de livraison nécessite un bref optimisation du type d'appareil et les conditions d'exploitation pour les applications non signalés précédemment. Les instructions fournies sont généralisables à la plupart des types de cellules et des matières de livraison, ce système ne nécessite pas des tampons spécialisés ou des étapes de modification chimique / d'orthographe. Ce travail permet également des des recommandations sur la façon d'améliorer les performances de l'appareil et dépanner les problèmes potentiels liés à l'obstruction, l'efficacité de la prestation faibles, et la viabilité cellulaire.

Introduction

Délivrance de macromolécules vers le cytoplasme de la cellule est une étape critique dans les applications thérapeutiques et de recherche. Nanoparticules médiation livraison, par exemple, a montré un potentiel en thérapie génique ^1,2, tandis que la prestation de protéine est un moyen prometteur d'affecter la fonction cellulaire à la fois clinique et de laboratoire ^{3 4} paramètres. D'autres matériaux, tels que les médicaments à petites molécules, des points quantiques, ou des nanoparticules d'or, sont d'un intérêt dans des applications allant de la thérapeutique du cancer ^{de 5,6} à ^7,8 marquage intracellulaire, et seule molécule de suivi ^9.

La membrane cellulaire est en grande partie imperméable aux macromolécules. De nombreuses techniques existantes utilisent des nanoparticules polymériques ^10,11 liposomes ^12, ou des modifications chimiques ¹³ à faciliter la rupture de la membrane ou de la livraison d'endocytose. Dans ces procédés, l'efficacité d'administration et de la viabilité des cellules est souvent dépendante de la structure de the molécule cible et du type de cellule. Ces méthodes peuvent être efficaces à la livraison de produits de structure uniforme, tels que les acides nucléiques, mais sont souvent mal adaptés pour la livraison de plus structurellement divers matériaux, tels que les protéines et les nanomatériaux ^{14,15 7.} En outre, le mécanisme de rupture d'endosome que la plupart de ces méthodes s'appuient sur ​​est souvent inefficace, cela laisse donc beaucoup de matériel piégé dans les structures vésiculaires ^16. Enfin, les méthodes qui sont souvent développés pour une utilisation avec des lignées cellulaires établies ne se traduisent pas bien de cellules primaires.

Membrane de poration méthodes telles que l'électroporation, ^17,18 et ¹⁹ sonoporation, sont une alternative intéressante dans certaines applications, mais ils sont connus pour provoquer une faible viabilité des cellules et peut être limitée par la charge du matériau de fourniture de cible.

Déformation mécanique rapide des cellules, une approche microfluidique à la livraison, a récemment demonstrés ses avantages par rapport aux techniques actuelles, dans le contexte de la reprogrammation de la cellule ²⁰ et la livraison de nanomatériau ^21. Cette méthode repose sur la rupture mécanique o la membrane de la cellule pour faciliter la délivrance cytosolique de matériaux présents dans le tampon environnant. Le système a démontré un potentiel permettant de contester auparavant types de cellules (cellules immunitaires primaires et les cellules souches par exemple) et les matériaux (par exemple des anticorps et des nanotubes de carbone). Ici, le mode opératoire général d'utiliser ces dispositifs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules cibles est décrite. La procédure est généralisable à la plupart des types de cellules et de matériaux de livraison, mais il est recommandé que l'on mener une brève optimisation des conditions, comme indiqué dans nos directives de conception signalés précédemment ^20, pour les applications non signalés précédemment. A ce jour, le système a été utilisé avec succès pour la fourniture de l'ARN, de l'ADN, des nanoparticules d'or, des points quantiques, des nanotubes de carbone, des protéiness, et des polymères de dextrane ^20,21.

Protocole

Une. Stockage

1. Stocker les réservoirs, supports, joints toriques et des dispositifs microfluidiques dans 70% d'éthanol. Utilisation d'un récipient (par exemple, bocal ou bécher) muni d'un couvercle pour empêcher l'évaporation et la contamination par des particules de poussière ou à l'extérieur. Placez les appareils dans un récipient (1), les réservoirs et les joints toriques dans un second récipient (2), et les détenteurs de la troisième (3).

Remarque: L'utilisation d'éthanol à 70% pour le stockage est de maintenir la stérilité. Si les seuls composants de la solution sont l'éthanol et de l'eau (pas de des agents de dénaturation), tous les composants du système doivent être totalement compatibles et ne se dégradent pas au fil du temps.

2. Changer solution d'éthanol dans des récipients (2) et (3) avant chaque utilisation pour éviter la contamination croisée entre les expériences et minimiser la présence de particules indésirables qui peuvent causer l'obstruction.

2. Expérience Préparation

1. Placer les récipients (2) et (3) dans un bain à ultrasons for 10.5 min avant chaque utilisation. Cela permet de supprimer toutes les particules contaminantes à partir des expériences précédentes.
2. Propre espace de travail en matière de biosécurité armoire avec une solution d'éthanol à 70%.
3. Pulvériser tous les matériaux (3 conteneurs, et pinces à épiler) avec une solution d'éthanol à 70% avant de les placer à l'intérieur du poste de sécurité microbiologique.

3. Assemblage

1. Fixées 2-3 lingettes faible charpie dans la zone de travail.
2. Retirer les réservoirs en matière plastique à partir de leur récipient avec des pinces et les mettre sur les lingettes pour faciliter l'évaporation de la solution d'éthanol à partir de surfaces intérieures. Tapoter doucement les réservoirs sur la surface ou souffler de l'air à travers eux pour faciliter l'élimination de la solution de l'éthanol.
3. Insérer les joints toriques dans leur emplacement approprié sur les réservoirs.
4. Retirez le support et les jetons de conteneurs respectifs et permettre à l'éthanol s'évapore (~ 1-2 min).
5. Utilisez des pinces pour placer la puce face-up désirée (c.-à-trous d'accès haut) dans le support. Soulevez le supportavec la puce à Eyelevel pour s'assurer que la puce est bien à plat dans le support et ajuster si nécessaire avec la pince à épiler. IMPORTANT: Si l'appareil ne s'adapte pas correctement dans son support, il ya un risque que ça casse lors des étapes ultérieures.
6. Ensuite, placez doucement les réservoirs sur le support et les aligner sur les clips. Veillez à ce que les joints toriques ne tombent pas de leurs logements pendant ce processus.
7. Appuyez doucement sur les réservoirs jusqu'à ce qu'ils s'enclenchent. Veiller à ce que les deux côtés des réservoirs sont en sécurité et que la puce semble être dans la bonne position.

4. Préparation cellulaire

1. Pour les cellules adhérentes (lignes primaires ou établies): les cellules des plaques de 1 à 2 jours avant l'expérience, de telle sorte qu'ils ne sont plus que 80% de confluence le jour de l'expérience.
2. Placez les cellules en suspension (dans du PBS ou support approprié) et viser une concentration d'exploitation de 1,0 x 10 ⁶ cellules / ml à 1,0 x 10 ⁷ cells / ml. NOTE: Nous n'avons pas observé de modifications significatives de la performance de livraison dû à la concentration cellulaire.
3. Mélanger les cellules et le matériau de libération souhaité dans un tube séparé pour obtenir la concentration désirée de matière pour l'expérience. IMPORTANT: En raison de la méthode de livraison décrit repose sur la diffusion de faciliter la livraison, une concentration de matière supérieur donnera livraison ultérieure. Si possible, il est recommandé d'utiliser une solution de 1 pM de la matière désirée pour les premiers essais. Cette concentration peut alors être augmentée dans de futures expériences en tant que de besoin. La concentration la plus faible signalée utilisée avec cet appareil est de 10 nM ^21.

5. Opération

1. mélange de pipette de cellules et le matériel de livraison dans un réservoir (conception actuelle a un max capacité de 150 pi). REMARQUE: La plupart des modèles d'appareil sont totalement réversibles donc direction d'écoulement dans les canaux n'a pas d'importance. Des échantillons peuvent être chargés dans l'un des deux réservoirs.
2. Fixer le tube de pression dans le réservoir rempli et serrez l'écrou pour assurer une bonne étanchéité (à la main est souvent suffisante).
3. Régler la pression au niveau désiré sur le régulateur. Ce contrôle la vitesse à laquelle les cellules se déplacent à travers le dispositif. Notez que les flux de cellule ne démarre pas tant que le bouton est pressé.

REMARQUE: Dans des travaux antérieurs, de l'azote ou de l'air comprimé ont travaillé aussi bien comme gaz porteur.

4. Dispositif pour élever le niveau des yeux et de l'orienter de sorte que le liquide dans le réservoir est facilement visible. NOTE: Suivre la colonne de liquide pour éteindre le système avant que le réservoir est vidé.
5. Appuyez sur le bouton pour mettre sous pression le réservoir et commencer flux de cellules.
6. Lorsque le niveau du liquide se trouve à environ 2 mm du fond du réservoir, tourner rapidement le régulateur à 0 psi pour arrêter l'écoulement. IMPORTANT: Si l'on ne parvient pas à arrêter l'écoulement avant que le réservoir est vide, on risque d'éjecter l'échantillon de la collection réservoir. Notez aussi que si la colonne de fluide ne se déplace pas à un rythme appréciable, ou a ralenti sensiblement par rapport à son débit initial (par exemple 3x plus lent), le dispositif monté est probablement bouché et doit être échangée. Fonctionnement d'un dispositif bouché peut conduire à la mort cellulaire plus élevé.
7. Recueillir les cellules traitées à partir du réservoir approprié et placez-les dans le tube de collecte / plaque désirée. IMPORTANT: Ne pas diluer les cellules recueillies dans tous les tampons à ce stade que les cellules porée continueront d'absorption matériau jusqu'à 10 min ^20. Après cette fenêtre a passé, diluer les cellules dans les médias / tampon désiré.
8. Pour recueillir des cellules traitées plus ou essayez conditions expérimentales alternatives, répétez les étapes 5.1 à 5.7 selon les besoins. Rappelons que les puces sont réversibles, par conséquent, les échantillons peuvent être montées dans les deux réservoirs. Assurez-vous d'échanger les jetons au besoin si ils bouchent. Jeter dispositifs obstrués.

6. Démontage

1. Débrancher délicatement les réservoirs de la porte principale en écartant les bras de clip.
2. Placez chaque partie dans le récipient de stockage approprié (décrit dans la section 1).
3. Placez puces utilisées dans un récipient séparé pour l'élimination.

Résultats

La figure 1 contient un schéma descriptif du système de délivrance microfluidique. Figures 2a-b illustrent des résultats représentatifs de traitement de cellules HeLa avec différents modèles d'appareil en présence de fluorescence conjugué dextrane ²⁰ 3 kDa. Si la procédure est correctement suivie, la performance du système sera sensible à type d'appareil et la vitesse de fonctionnement. Par conséquent, il faut optimiser ces conditions pour une application...

Discussion

Peuvent avoir besoin d'être optimisé en fonction du type cellulaire et de matériau de libération du système est appliqué à certains aspects de la procédure expérimentale décrite (à savoir les facteurs autres que la conception de la puce et de la vitesse de fonctionnement). La discussion qui suit aborde certaines des facteurs les plus communs à considérer lors de la conception des expériences.

Pour améliorer le signal de livraison pour les composés marqués par fl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Holder & Plastic reservoir	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A	Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Rings	McMaster	9452K311
Pressure system to operate device	SQZ Biotechnologies	Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath