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  • Discusión
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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La administración de dos análogos de timidina, edu y BrdU, en ratones embarazada permite el análisis de la progresión del ciclo celular en células progenitoras neurales y en el cerebro de ratón embrionario. Este método es útil para determinar los efectos del estrés genotóxico, incluyendo la radiación ionizante, durante el desarrollo del cerebro.

Resumen

Las neuronas de la corteza cerebral se generan durante el desarrollo cerebral de diferentes tipos de células madre y progenitoras neuronales (CPSN), que forman un epitelio pseudoestratificado que reviste los ventrículos laterales del cerebro embrionario. Tensiones genotóxicos, como la radiación ionizante, tienen efectos muy nocivos sobre el desarrollo del cerebro relacionada con la alta sensibilidad de NSPC. La elucidación de los mecanismos celulares y moleculares implicados depende de la caracterización de la respuesta al daño de ADN de estos tipos particulares de células, que requiere un método preciso para determinar CPSN progresión a través del ciclo celular en el tejido dañado. Aquí se muestra un método basado en sucesivas inyecciones intraperitoneales de Edu y BrdU en ratones embarazadas y aún más la detección de estos dos análogos de la timidina en secciones coronales del cerebro embrionario. Edu y BrdU se incorporan tanto en el ADN de las células de replicación durante la fase S y se detectan mediante dos técnicas diferentes (o azidaun anticuerpo específico, respectivamente), lo que facilita su detección simultánea. Edu y tinción de BrdU se determinan entonces para cada núcleo CPSN en función de su distancia desde el margen ventricular en una región estándar del telencéfalo dorsal. Por lo tanto esta técnica de doble etiquetado permite distinguir las células que progresaron a través del ciclo celular de los que han activado un punto de control del ciclo celular que conduce a la detención del ciclo celular en respuesta al daño del ADN.

Un ejemplo de experimento se presenta, en el que se inyectó EdU antes de la irradiación y BrdU inmediatamente después y análisis realizados en el 4 horas después de la irradiación. Este protocolo proporciona un análisis preciso de la respuesta al daño de ADN aguda de CPSN en función de la fase del ciclo celular en la que se han irradiado. Este método es fácilmente extrapolable a muchos otros sistemas con el fin de determinar el impacto de un tratamiento particular en la progresión del ciclo celular en los tejidos vivos.

Introducción

Durante el desarrollo embrionario del cerebro, las neuronas de proyección de la corteza cerebral se generan en la zona ventricular, un epitelio pseudoestratificado compuesto de diferentes tipos de células madre neurales y células progenitoras (CPSN) que recubre los ventrículos laterales. Entre CPSN, las células gliales radiales (RGC), que sirven como células madre neurales, se someten a la migración nuclear interkinetic (INM): que realizan la mitosis en la superficie del ventrículo y la fase S en el límite basal de la zona ventricular (VZ) 1, 2,3. Ellos pueden dividir de forma simétrica para generar dos RGC o asimétricamente para generar una RGC y una neurona o una célula progenitora intermedia (IPC) 4, 5. IPC migrar a una capa superpuesta que proliferan llamada zona subventricular (SVZ), donde después de una última división simétrica generan dos neuronas de proyección inmaduros 6-8. Contrariamente a la RGC, IPC no sufren INM (revisado en 9). Neuronas recién generadas MIGRcomió radialmente a lo largo de las fibras radiales a través de la zona intermedia (IZ) para llegar a su destino final en la placa cortical (CP) 10, 8. La sincronización perfecta de todos estos eventos es esencial para un desarrollo cortical correcta. Por ejemplo, el interruptor de la proliferación a la diferenciación de las poblaciones progenitoras neuronales se controla por la duración de la fase G1 11, 12. El alargamiento de la fase G1 se correlaciona tanto con la diferenciación celular.

Estrés genotóxico, como la radiación ionizante, el desarrollo del cerebro dañar seriamente (revisado en 13). Nosotros y otros han demostrado que NSPC son muy propensas a la apoptosis inducida por la radiación-14, 15,16. Las radiaciones ionizantes inducen ADN de doble filamento se rompe que son el daño más severo a las células proliferantes. Un componente esencial de la respuesta al daño del ADN (DDR) en el ciclo de las células es la activación de los puntos de control del ciclo celular en la transición G1 / S o G2 / M transición o durante Sfase (intra-S de control) 17-21. Ellos bloquean la progresión del ciclo celular para proporcionar tiempo para la reparación del daño en el ADN o eliminación de células demasiado dañados. En consecuencia, la muerte celular, así como la progresión del ciclo celular retardada pueden alterar el desarrollo del cerebro en respuesta a la exposición a radiaciones ionizantes 22-24. Por lo tanto, era interesante desarrollar un método para evaluar la activación de puntos de control del ciclo celular en CPSN en el cerebro de ratón embrionario irradiado.

La progresión del ciclo celular es seguida de forma rutinaria utilizando la incorporación de un análogo de timidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU). BrdU se incorpora durante la fase S del ciclo celular, cuando el ADN se replica. El uso de un anticuerpo contra BrdU a partir de entonces permite la detección de células que se encontraban en la fase S durante el pulso de BrdU.

Un nuevo análogo de timidina, 5-etinil-2'-desoxiuridina (edu) se detecta por una azida fluorescente. Las diferentes maneras de detectar Edu y B RDU no reacciona de forma cruzada 25, lo que permite la detección simultánea de ambos análogos de timidina, que es útil para el estudio de la progresión del ciclo celular. Por lo general, las células se pulsaron con primera edu y pulsaron entonces con BrdU, en el que el tiempo entre las dos incorporaciones dura par de horas 25, 26. La adición de BrdU en medio de cultivo que contiene EdU preferentemente resulta en la incorporación de BrdU en el ADN con la exclusión de edu, mientras que la adición simultánea de EdU 25 con BrdU equimolar o medio equimolar a los resultados de los medios de comunicación en sólo incorporación de BrdU 27. Esto simplifica el protocolo de doble etiquetado mediante la eliminación de los pasos de lavado que normalmente se requieren para eliminar la primera etiqueta del medio de cultivo antes de la adición de la segunda etiqueta. Esto también es de especial interés para el estudio in vivo, donde los pasos de lavado no son posibles, para determinar el momento preciso de la entrada en la fase S o la salida de la población celular.

t "> Recientemente, un método de etiquetado de doble pulso en el cerebro embrionario de ratón usando edu y BrdU 23, 24,22 se ha desarrollado para analizar la progresión del ciclo celular y el INM de CPSN después de la irradiación en el útero. Además, se ha demostrado que, durante fase S, células de ratón se replica en primer lugar las regiones de eucromatina y heterocromatina entonces el pericéntrica 28,29,30. Curiosamente, la heterocromatina pericéntrica de diferentes cromosomas agrupados en núcleos interfásicos para formar focos de heterocromatina también conocido como chromocenters y fácilmente detectable por tinción con DAPI como focos brillantes. Por lo tanto, los diferenciales Edu y BrdU tinciones de eucromatina y chromocenters nos ayudaron a analizar con mayor precisión la progresión de la fase S de NSPC.

Este método permite la demostración de la aparente falta de G1 / S de control en NSCP 22-24, que es bastante sorprendente, ya que este punto de control se supone que es crítico para la estabilidad del genoma. Varios experimental diseños basados ​​en diversas combinaciones de edu y BrdU pulsos se han utilizado para analizar la progresión del ciclo celular en el telencéfalo ventral y dorsal. Aquí, le damos un ejemplo de protocolos que permiten el estudio del daño en el ADN aguda de NSPC dentro de las primeras 4 horas después de la irradiación en el útero de embriones E14.5 ratón.

Protocolo

1. Los procedimientos con animales

Este protocolo ha sido diseñado de acuerdo con la Directiva del Consejo Europeo de Comunidades de 24 de Noviembre de 1986 (86/609/CEE) y ha sido aprobado por nuestro comité institucional sobre bienestar animal (CETEA-CEA DSV IDF).

  1. Las inyecciones con edu / BrdU y la irradiación de E14.5 ratones preñados (Figura 2A).
    1. Preparar una solución de EdU a 1 mg / ml y de BrdU a 5 mg / ml en PBS. Realice una inyección intraperitoneal (IP) de 100 l de solución de EdU utilizando una aguja de 25 G en ratones embarazadas. 1.5 h más tarde, irradiar los ratones (irradiación corporal total) a 0 Gy o 2 Gy (0,6 Gy / min). Inmediatamente después, se inyectan (IP) 200 l de solución de BrdU utilizando una aguja de calibre 25 en los ratones embarazadas.
  2. Preparación de cortes coronales de cerebro embrionarias.
    1. En 1 hora o 4 horas después de la irradiación, la eutanasia a los ratones preñados por el dióxido de carbono.
    2. Abra la cavi abdominalty más de tres centímetros con unas tijeras. Separar los dos cuernos uterinos del resto del útero mediante el seccionamiento de ambas extremidades de los cuernos. La transferencia de los cuernos uterinos en una placa de Petri que contenía PBS 0,6% de glucosa. Abra los cuernos uterinos con los fórceps con el fin de aislar los embriones. Retire la bolsa de líquido amniótico de cada embrión con unas pinzas.
    3. Diseccionar cabezas de embriones con unas pinzas y fijarlos por inmersión en paraformaldehído al 4% (PFA, pH = 7,4) O / N a 4 ° C.
    4. Enjuague cabezas de embriones en PBS durante al menos una noche a 4 ° C. Jefes se pueden mantener en PBS durante varios días.
    5. Cabezas Insertar en parafina usando un procesador de infiltración al vacío como se indica en la Tabla 1. Jefes de incrustación también se puede realizar bajo una campana química para el etanol y baños de xilol, y luego en un horno de 65 ° C para los baños de parafina.
    6. Preparar 5-m de espesor secciones coronales con un microtomo.
    7. Montar en portaobjetos de microscopio recubiertos con polilisina.
    8. Las diapositivas se pueden mantener a temperatura ambiente (TA) durante varios meses.

2. Edu / BrdU tinción

  1. Desparafinización y antígeno desenmascarar
    1. Desparafinar las secciones del cerebro embebidos en parafina por inmersión de los portaobjetos en 3 baños de tolueno durante 5 min.
    2. Se rehidrata durante 3 min en 2 baños de cada uno soluciones de la disminución de la concentración de etanol de la siguiente manera: etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70%, y 5 min en H 2 O. Las diapositivas se pueden mantener en agua desionizada durante varias horas.
    3. Hervir las rodajas durante 10 min en solución de citrato (10 mM, pH 6), y luego incubar en agua desionizada durante 5 min.
  2. Tinción EdU
    1. Realizar la detección de EdU de acuerdo con el protocolo del fabricante. Permeabilizar las células con 0,5% de Triton X-100 en PBS durante 10 min.
    2. Preparar aditivo tampón 1X EdU diluyendo la solución 10 veces en agua desionizada. Esta solución debe ser recién hecho y utilizado en el mismo daY.
    3. Preparar EdU cóctel de reacción, incluyendo EdU Alexa Fluor 488 azida. Es importante añadir los ingredientes siguiendo el orden indicado en la Tabla 2, de otro modo, la reacción no se procederá de manera óptima. Utilice el cóctel reacción EdU en los 15 minutos de preparación.
    4. Retire la permeabilización de amortiguación (paso 2.1.1), luego se lava dos veces con PBS.
    5. Añadir 150 l de EdU cóctel de reacción, poner un cubreobjetos, y se incuba durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
    6. Retire el cóctel reacción Edu, luego lavar una vez con PBS.
  3. Tinción BrdU
    1. Preparar tampón de saturación con 7,5% de suero de cabra y suero bovino fetal al 7,5% en PBS. Añadir 150 l de tampón de saturación en rodajas de cerebro, colocar un cubreobjetos, y se incuba durante 1 hora a TA para bloquear anticuerpo inespecífico vinculante.
    2. Quite el cubreobjetos. Añadir 150 l de ratón anti-BrdU anticuerpo primario diluido a 1/300 en tampón de saturación, se puso un cubreobjetos y se incuban O /N a 4 ° C.
    3. Quite el cubreobjetos, luego lavar 3 veces en PBS.
    4. Añadir 150 l de anticuerpo de cabra anti-ratón-Alexa594 anticuerpo secundario diluido a 1/400 en tampón de saturación, poner un cubreobjetos, y se incuba durante 1 hora a TA.
    5. Quite el cubreobjetos, luego lavar una vez con PBS.
    6. Tinción nuclear: añadir 150 l de 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) a 1 g / ml en PBS, se puso un cubreobjetos y se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    7. Montar las diapositivas en medio de montaje.

3. Análisis

  1. Examine las secciones del cerebro bajo un microscopio de fluorescencia con un objetivo 20X o un microscopio confocal y adquirir imágenes en tres canales (488 nm, 594 nm y UV) como separa archivos.
  2. Pila de imágenes con el software Photoshop.
  3. Analizar las secciones del cerebro en un sector estándar de la pared cerebral dorsomedial. Este sector es de 100 micras en su dimensión medial-lateral y está dividida en 18 contenedores (o más) de 10 μm de altura en su dimensión radial usando una cuadrícula superpuesta sobre imágenes (Figura 1) como se ha descrito previamente 31.
    1. Alinear la red, tales como el primer bin está en la superficie ventricular, con su eje largo paralelo a la frontera del ventrículo. Luego el número de la etiqueta EdU, BrdU y / o núcleos picnóticos (correspondiente a los núcleos apoptóticos) en cada bin. Número A núcleo situado en el límite de dos contenedores en el depósito que contiene su mayor parte, o en la papelera inferior, cuando el núcleo ocupa áreas iguales dentro de los dos contenedores.
  4. El análisis estadístico.

Analizar al menos dos rebanadas corticales por embrión. Repita los experimentos en al menos 3 embriones de diferentes camadas. Los resultados deben ser dados como media ± error estándar de la media (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron con Graphpad Prism usando ANOVA de dos vías y múltiples pruebas posthoc comparación Bonferroni.

Resultados

En el experimento descrito en la Figura 2, EdU se administró 1,5 horas antes de la irradiación y de BrdU sólo después de la irradiación. Cuatro tipos de células se distinguen en las rodajas corticales preparadas en 1 o 4 horas después de la irradiación, de acuerdo a la incorporación de cualquiera de EdU o BrdU, ambos o ninguno (Figuras 2A y 2B). Es importante destacar que, ni EdU ni la incorporación de BrdU cambiar el nivel de la apoptosis inducida por la radi...

Discusión

El diseño experimental descrito aquí basado en la incorporación de EdU 1,5 horas antes de la irradiación y la incorporación de BrdU inmediatamente después de la irradiación permitió la demostración de que NSPCs son capaces de activar S y puntos de control G2 / M pero no el punto de control G1 / S durante la 1 ª hora después de un estrés genotóxico en el cerebro del ratón fetal. Se realizaron otros experimentos en los que se ha inyectado EdU en diferentes momentos después de la irradiación y Br...

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación de la Unión Europea del Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención n ° 323267, de Electricité de France (EDF) y de l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
EdULife TechnologiesA100441 mg/ml
BrdULife TechnologiesB50025 mg/ml
IBL 637CIS BIO International
Tissu Tek VIPLeica
MicrotomeLeicaRM 2125 RT
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kitLife TechnologiesC10083
Anti-BrdUGE HealthcareRPN2021/300
Goat anti mouse-Alex594Life TechnologiesA110011/400
FluoromountSouthernBiotech0100-01
Polysine slideThermo scientificJ2800AMNZ
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBSLife Technologies20012-068
DAPISigma-AldrichD9542
Microscope BX51Olympus
Confocal microscope SPELeica
Prism softwareGraphpadVersion 5.0c
Photoshop softwareAdobe

Referencias

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