神経幹細胞の細胞周期の進行を評価し、マウスでの前駆細胞は、遺伝毒性ストレス後の脳の開発

要約

妊娠マウスにおけるチミジンのEdUおよびBrdUの二類似体の投与は、胚性マウス脳の神経細胞および前駆細胞における細胞周期進行の分析を可能にする。この方法は、脳の発達の間に、電離放射線を含む遺伝毒性ストレスの効果を決定するために有用である。

要約

大脳皮質の神経細胞は、胚の脳の側脳室の内側を覆う多列上皮を形成し、神経幹細胞および前駆細胞の様々なタイプ（NSPC）から脳の発達の間に生成される。このような電離放射線などの遺伝毒性ストレスは、NSPCの高感度に関係する脳の発達に大きく悪影響を及ぼす。関与する細胞および分子機構の解明は、損傷した組織における細胞周期を通してNSPCの進行を決定する正確な方法を必要とする細胞のこれらの特定の種類のDNA損傷応答の特性に依存する。ここで妊娠マウス胚性脳の冠状断面におけるこれら2チミジン類似体の更なる検出においてのEdUおよびBrdUの連続腹腔内注射に基づく方法が示されている。のEdUおよびBrdUの両方S期の間複製細胞のDNAに組み込まれ、2つの異なる技術（又はアジドによって検出されるそれらの同時検出を容易に特異的な抗体、それぞれ）。のEdUとBrdU染色は、その後、背側終脳の標準領域における心室余白からの距離の関数で各NSPC核について決定される。したがって、この二重標識技術は、DNA損傷に応答して細胞周期の停止をもたらす細胞周期チェックポイントを活性化したものから、細胞周期を通して進行する細胞を区別することができる。

実験の例はEdUのは直後に、照射およびBrdUの前に注入し、照射後4時間以内に行わ分析する、提示されている。このプロトコルは、それらが照射された時に細胞周期の位相の関数でNSPCの急性DNA損傷応答の正確な分析を提供する。この方法は、生体組織中の細胞周期の進行に対する特定の治療の影響を決定するために容易に転移他の多くのシステムにある。

概要

胚の脳の発達の際に、大脳皮質の投射ニューロンは、神経幹細胞および前駆細胞（NSPC）の様々なタイプで構成多列上皮はそのライン側脳室、脳室帯で生成されます。 NSPC、神経幹細胞として機能する放射状グリア細胞（RGC）の中で、interkinetic核移行（INM）を受ける：彼らは脳室帯（VZ）の基底限界で心室とS相の表面で有糸分裂を行う^1、2,3。彼らはどちらか分けることができる対称的に2 RGCを発生させるか、非対称に1 RGCと1ニューロンまたは中間前駆細胞^{（IPC）4、5を}生成する。 IPCは1、最後の対称分裂後、彼らは2未熟投射ニューロン^6-8を生成する脳室下帯（SVZ）と呼ばれるその上に増殖層に移行します。 RGCに反して、IPCは^（9に概説されている）INMを受けない。新しく生成されたニューロンMIGR皮質板^{（CP）10、8}で最終的な宛先に到達するために中間ゾーン（IZ）を介してラジアル繊維に沿って放射状に食べました。すべてのこれらのイベントの完璧なタイミングが正しい皮質発達に必須である。例えば、神経前駆細胞集団の分化増殖のスイッチは、G1期の持続^11,12によって制御される。 G1期の延長は、細胞の分化と相関するこうして。

このような^（13に概説されている）、電離放射線、ひどく損なう脳の発達などの遺伝毒性ストレス、。私たちは、他はNSPCは、放射線誘導性アポトーシス^14、15,16に非常に傾向があることが示されている。電離放射線は、増殖している細胞に最も深刻な被害であるDNA二本鎖切断を誘導する。サイクリング細胞におけるDNA損傷応答（DDR）の一つの必須成分は、G1 / SまたはG2 / M遷移における又はSの間の細胞周期チェックポイントの活性化である相（イントラSチェックポイント^{）17〜21。}それらは、DNA損傷修復すぎたり損傷を受けた細胞の排除のための時間を提供するために、細胞周期の進行をブロックする。従って、細胞死、ならびに遅延、細胞周期の進行は、放射線曝露^22-24電離に応答して、脳の発達を変更することができる。これは、照射したマウス胚性脳におけるNSPCにおける細胞周期チェックポイントの活性化を評価するための方法を開発することは興味深かった。

細胞周期の進行は、定期的に、チミジン類似体、5 - ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）の取り込みを使用して追跡する。 DNAが複製されるときにBrdUは、細胞周期のS期の間に組み込まれる。のBrdUに対する抗体の使用は、その後のBrdUのパルスの間にS期にある細胞の検出を可能にする。

新規のチミジン類似体、5 - エチニル-2'-デオキシウリジン（EdUの）は、蛍光アジドによって検出される。のEdUとBを検出するために様々な方法 RDUは、細胞周期の進行の研究に有用である両方のチミジン類似体の同時検出を可能にする^、25に交差反応しない。通常の細胞は最初のEdUをパルスした後、両方の取り込み間の時間は、時間^25、26のカップルを持続するのBrdUでパルスする。唯一のBrdUの取り込み²⁷のメディアの結果と等モルまたはハーフモルBrdUによるEdUの²⁵の同時添加しながら、EdUを排除してDNAへのBrdUの取り込みを優先におけるEdUの結果を含む培養培地中のBrdUの追加。これは、通常、前に第二の標識の添加培地から最初のラベルを削除するために必要とされる洗浄ステップを排除することによって、二重標識プロトコルを簡素化します。これはまた、細胞集団のS期の出入りの正確なタイミングを決定するために、洗浄工程が不可能なインビボ研究のために特に重要である。

t "の>最近、EdUのおよびBrdU ^{23、24,22を}用いて、胚性マウス脳におけるデュアルパルス標識する方法は、 子宮内照射における後の細胞周期の進行およびNSPCのINMを分析するために開発された。また、それが実証されている間に、そのS期は、マウスの細胞をまずユークロマチン領域とし、ペリセントリックヘテロクロマチン^28,29,30を複製します。興味深いことに、interphasic核内にクラスタ化された異なる染色体の挟動原体ヘテロクロマチンもchromocentersとして知られており、鮮やかな焦点とDAPI染色によって容易に検出可能なヘテロクロマチンフォーカスを形成する。そのため、ユークロマチンとchromocentersの差分のEdUおよびBrdU染色をより正確にNSPCのS期の進行​​を分析するために、私たちを助けた。

このメソッドは、このチェックポイントがゲノムの安定性にとって重要であると考えられるので、非常に驚くべきことであるNSCP ^22〜24でのG1 / Sチェックポイントの見かけの欠如、のデモを許可された。いくつかのEXPのEdUおよびBrdUパルスのさまざまな組み合わせに基づいて、erimental設計は、腹側と背側終脳における細胞周期の進行を分析するために使用されてきた。ここでは、E14.5マウス胚の子宮内照射に続く最初の4時間以内でNSPCの急性DNA損傷の研究を可能にするプロトコルの例を与える。

プロトコル

1。動物の手順

このプロトコルは、11月24日の欧州共同体理事会指令、1986（86/609/EEC）に準拠して設計されており、動物福祉（CETEA-CEA DSV IDF）で、当社の機関の委員会によって承認されている。

1. のEdU / BrdUおよびE14.5妊娠マウス（ 図2A）を照射して注射。
   1. PBS中5ミリグラム/ mlで添加し、BrdUを1ミリグラム/ ATのEdUの溶液を調製する。妊娠中のマウスに25 G針を使用してのEdU溶液100μlを腹腔内注射（IP）を実行します。 1.5時間後、0グレイまたは2 Gyの（0.6線量/分）でマウス（全身照射）を照射する。直後に、妊娠中のマウスに25 G針を使用してのBrdU液（IP）200μLを注入。
2. 胚の脳の冠状スライスの準備。
   1. 1時間又は照射後4時間で、二酸化炭素によって妊娠マウスを安楽死させる。
   2. 腹部CAVIを開くはさみを使用して3センチ出るTY。ホーンの両方四肢を区画し、子宮の残りの部分から2子宮角を分離する。 PBS、0.6％のグルコースを含むペトリ皿に子宮角を転送します。胚を単離するために鉗子で子宮角を開きます。鉗子を使用して、各胚の羊膜嚢を削除します。
   3. 鉗子で胚の頭部を解剖し、4℃で4％パラホルムアルデヒド（PFA液、pH = 7.4）O / Nに浸漬することによってそれらを修正
   4. 4℃で少なくとも一晩PBS中で胚の頭をすすぐヘッドは、数日間PBSに維持することができる。
   5. 表1に示すように真空浸透処理を用いてパラフィン中に埋め込 ​​むヘッド。ヘッド埋め込 ​​みはまた、エタノールおよびキシレン中浴の化学フード下で行われ、次いで、パラフィン浴65℃のオーブン中ですることができる。
   6. ミクロトームで5μmの厚さの冠状切片を準備します。
   7. ポリリジンでコーティングされた顕微鏡用スライド上にマウントします。
   8. スライドを数ヶ月間、室温（RT）に維持することができる。

2。のEdU / BrdUの染色

1. 脱パラフィンおよび抗原マスク解除
   1. 5分間トルエン3浴にスライドを浸漬することによりパラフィン包埋した脳切片を脱パラフィン。
   2. 100％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、5分間H ₂ O中に次のようにエタノール濃度を低下させるの各溶液の2浴中で3分間再水和するスライドは、いくつかの時間脱イオン水に保つことができる。
   3. クエン酸溶液（10ミリモル、pH6）中で10分間スライスを沸騰し、次に5分間脱イオン水中でインキュベートする。
2. EdUの染色
   1. 製造業者のプロトコルに従ってEdUの検出を行う。 10分間PBS中0.5％トリトンX-100で細胞を透過。
   2. 脱イオン水に10倍の溶液を希釈することで1XのEDUバッファ添加物を準備します。このソリューションは、新たに作られ、同じDA上で使用する必要がありますY。
   3. EdUのアレクサフルーア488アジ化を含め、のEDU反応カクテルを準備します。それは、表2に示されている順序以下の成分を添加することが重要である、そうでなければ、反応が最適に進行しない。準備の15分以内のEDU反応カクテルを使用してください。
   4. PBSで2回洗った後、透過処理バッファー（ステップ2.1.1）を取り外します。
   5. のEDU反応カクテルの150μl加え、カバーグラスを入れて、室温で暗所で30分間インキュベートする。
   6. のEDU反応カクテルを削除した後、PBSで1回洗浄。
3. BrdU染色
   1. 7.5％ヤギ血清、PBS中の7.5％ウシ胎児血清を飽和バッファーを準備します。 、脳スライスに飽和バッファーの150μl加え、カバーグラスを入れて、非特異的抗体結合をブロックするために、室温で1時間インキュベートする。
   2. カバーガラスを取り外します。飽和バッファー中で1/300に希釈したマウス抗BrdU一次抗体150μl加え、/カバースリップを置くとOインキュベート4℃で、N
   3. カバーガラスを外し、次にPBSで3回洗浄する。
   4. 飽和バッファー中で1/400に希釈したヤギ抗マウスをAlexa594二次抗体150μl加え、カバーグラスを入れて、室温で1時間インキュベートする。
   5. PBSで一度洗った後、カバーガラスを取り外します。
   6. 核染色：PBS中1μg/ mlの時に4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）の150μLを加え、カバーグラスを入れて、室温で2分間インキュベートする。
   7. メディアをマウントスライドをマウントします。

3。分析

1. 20Xの目的や共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡下で脳切片を調べて、ファイルを分離として3チャンネル（488ナノメートル、594ナノメートルとUV）で画像を取得する。
2. Photoshopソフトウェアで画像を積み重ねる。
3. 背内側脳壁の標準部門で脳切片を分析します。この部門では、その内側 - 横方向の寸法が100μmで、10μの18ビン（またはそれ以上）に分かれています先に説明したように^31を画像に重畳グリッドを使用してその半径方向の寸法におけるmの高さ（ 図1）。
   1. このような最初のビン、グリッドの位置を合わせ心室の境界にその長軸に平行で、心室表面である。その後、各ビンにラベルのEdU、BrdUおよび/または濃縮核（アポトーシス核に相当）の数。数の大部分が含まれているビン内、または核は2個のビンの中に等しい面積を占有している下のビン、中2のビンの境界に位置する核。
4. 統計分析。

胚あたり少なくとも2皮質のスライスを分析します。別の仔から少なくとも3胚で実験を繰り返します。結果は、平均値の平均値±標準誤差（SEM）として与えられるべきである。統計分析は、双方向ANOVAとボンフェローニ多重比較ポストホック試験を用いてグラフパッドプリズムを用いて行われる。

結果

図2に記載された実験では、EdUのちょうど照射後、照射前およびBrdU 1.5時間後に投与した。細胞の4つのタイプは、その後のEdUまたはBrdUの、両方かNoneの取り込みに応じて、1または4時間の照射後に調製皮 ​​質スライス識別された（ 図2Aおよび図2B）。重要なことに、EdUのも、BrdUの取り込みのいずれも、放射線誘導アポトーシス（データは示していない）...

ディスカッション

のEdU 1.5時間の取り込みに基づいてここで説明する実験計画の前に照射が許可された直後に照射し、BrdUの取り込みNSPCsの後、SおよびG2 / Mチェックポイントを活性化することができるが、1 ^回目の時間の間に、G1 / Sチェックポイントではありませんデモ胎児のマウス脳における遺伝毒性ストレス。私たちは、私たちは、特にS期のエントリの割合を鑑賞することができ、EdUのはちょうど1?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EdU	Life Technologies	A10044	1 mg/ml
BrdU	Life Technologies	B5002	5 mg/ml
IBL 637	CIS BIO International
Tissu Tek VIP	Leica
Microtome	Leica	RM 2125 RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit	Life Technologies	C10083
Anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1/300
Goat anti mouse-Alex594	Life Technologies	A11001	1/400
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01
Polysine slide	Thermo scientific	J2800AMNZ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS	Life Technologies	20012-068
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Microscope BX51	Olympus
Confocal microscope SPE	Leica
Prism software	Graphpad		Version 5.0c
Photoshop software	Adobe