En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

Resumen

Este informe describe una técnica sencilla y rápida de la aguja de punción intratecal para una transfección localizada de siRNA en la médula espinal lumbar de ratón bajo anestesia de corta luz duradera.

Resumen

En este informe se describe una guía paso a paso a la técnica de inyecciones intratecales agujas agudas de una manera no invasiva, es decir, independiente de la implantación del catéter. La limitación técnica de esta técnica quirúrgica se encuentra en la finura de las manos. La inyección es rápida, sobre todo para un investigador entrenado, y dado que la interrupción del tejido con esta técnica es mínima, las inyecciones repetidas son posibles; reacción además inmune a las herramientas de extranjeros (por ej. Catéter) no ocurre, dando así una mejor y más específica leer en voz de la modulación de la médula espinal. Dado que la aplicación de la sustancia se limita en gran parte a la región diana de la médula espinal, los fármacos no necesitan ser aplicado en grandes dosis, y efectos más importante no deseados en otro tejido, como se observa con un suministro sistémico, pueden ser eludidas ^{1, 2.} Además, combinamos esta técnica con la transfección in vivo de ácido nucleico con la ayuda de polyethylenimINE (PEI) de reactivo ^3, que proporciona una gran versatilidad para el estudio de funciones de la médula a través de la administración de agentes farmacológicos, así como de genes, ARN, y moduladores de proteínas.

Introducción

La médula espinal es un centro muy importante en una variedad de procesos biológicos fundamentales y funciones fisiológicas, incluyendo el procesamiento y la transmisión de entradas dolorosas (nociceptivo) ^4-7. Diversas técnicas experimentales se han desarrollado para facilitar la modulación farmacológica de la médula espinal, tales como la implantación crónica de catéteres intratecales ^8, la microinyección de la médula espinal, intratecal y la aguja de inyección ^9. Cada técnica tiene sus propias ventajas y desventajas, y dependiendo del paradigma experimento Una técnica podría ser más adecuado que los otros. Considerando que la implantación crónica de los catéteres intratecales es fácilmente factible en la rata, este método es muy difícil en el ratón, dadas las restricciones de tamaño. El índice de éxito es muy baja y el déficit motor a menudo se producen debido a la presencia voluminosa de un catéter en el espacio subdural severamente limitado en el ratón. Además, la administración a largo plazo de medicamentos se hace debido a la coagulación frecuentesde implantado crónicamente catéteres. Finalmente, las reacciones inmunes son comunes.

Estos problemas pueden ser evitados utilizando el método de la inyección intratecal aguda a través de una aguja en la ausencia de un catéter preimplanted, que permite una aplicación rápida y anatómicamente limitado de medicamentos y reactivos a la médula espinal en ratones. Este método mantiene plenamente los beneficios de la entrega intratecal sobre otras rutas de administración sistémica (por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, etc) tales como especificidad de la modulación espinal, que permite la reducción de las dosis y los efectos secundarios límite, así como la capacidad para entregar sustancias no hacen normalmente no atraviesan la barrera hematoencefálica ya que durante la inyección intratecal, se inserta la aguja entre la duramadre y la médula espinal. Es importante destacar sin embargo, en comparación con otros métodos de entrega intratecal, el método de inyección de aguja intratecal es el menos invasivo, lo que permite numerosas aplicaciones en lamismo animal sin causar ningún daño tisular considerable o evocando reacción inmune debido a la implantación de material extraño. Sin embargo, requiere habilidades técnicas para una orientación muy precisa de la aguja para permitir la eficacia.

Este sentido, demostrar visualmente el método para alcanzar una tasa óptima de éxito para la orientación específica de la médula espinal lumbar. El sitio de la inyección que se elige en este experimento es el surco entre L5 y L6 columna de vertebrados, cerca de donde termina la médula espinal, para reducir al mínimo la posibilidad de dañar la columna vertebral. Por otra parte, se demuestra el uso de esta técnica para derribar los genes en la médula espinal utilizando siRNAs.

Protocolo

Todos los procedimientos de uso de animales estaban en conformidad con las normas éticas establecidas por la Junta de Gobierno Local (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Alemania).

1. Preparación del Complejo siRNA / PEI

La solución de complejo de ARNsi / PEI se prepara utilizando las instrucciones del fabricante de la siguiente manera:

1. Solución A: Diluir la cantidad deseada de siRNA con agua estéril (si es necesario) hasta una cuarta parte del volumen final y diluir dicha adicionalmente con una solución de glucosa al 10% hasta la mitad del volumen final. Vortex o mezclar suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo. La cantidad óptima de siRNA se debe determinar empíricamente pero 1 mg siRNA en 10 l solución compleja por animal es un buen punto de partida para la optimización.
2. Solución B: Diluir el volumen necesario de reactivo PEI con agua estéril hasta una cuarta parte del volumen final y diluir dicha adicionalmente con una solución de glucosa al 10% hasta la mitad del volumen final. Vortex gently o mezclar pipeteando arriba y abajo.
   Nota: la cantidad de reactivo de PEI determina el equilibrio iónico en el complejo que influye en la eficiencia de la transfección. Del mismo modo la cantidad óptima de solución de PEI tiene que ser determinada empíricamente. En nuestras manos, la cantidad óptima es de 0,12 l de solución de PEI por 1 g de siRNA.
3. Mezclar la solución A con la solución B a la vez, vórtice suavemente.
4. Incubar la solución se mezcló durante 15 min a temperatura ambiente antes de su uso. Este complejo es estable durante 2 horas a temperatura ambiente y durante 24 horas a 4 ° C.

2. La inyección intratecal

1. Anestesiar el ratón con el 3% isoflurano, hasta que no muestra signos de reflejo de enderezamiento. Además, compruebe si hay cola y / o la pata pizca reflex para asegurar aún más el estado de anestesia.
2. Shave alrededor de 2 cm ² de piel en el extremo posterior del animal cerca de la base de la cola para facilitar una mejor visualización durante la inserción de la aguja.
3. Coloque el ratón enun cono de la nariz para una administración continua isoflurano durante el procedimiento, a reducir el isoflurano al 1,5%, y cubrir los ojos del ratón con lubricante ocular.
4. Prepare la lista para su uso siRNA solución mixta utilizando una jeringa Hamilton de 25 l adjunto a un 30 G 0,5 en la aguja.
5. Busque la apófisis espinosa de la L6, que debería ser el más destacado y fijar la columna de la vertebrado alrededor de esta área presionando suavemente.
6. Inserte cuidadosamente la aguja entre la ranura de L5 y L6 vértebras y observar por un movimiento de la cola ya que este signo indica una entrada exitosa de la aguja en el espacio intradural.
   Consejo: El uso de la uña, uno debe ser capaz de localizar la ranura también.
7. Una vez que se observa movimiento de la cola, de inmediato, pero con cuidado, asegurar la posición de la aguja con una mano e inyectar el volumen deseado de la sustancia con la otra mano lentamente.
   Consejo: un volumen de entre 5-10 l es óptima ya que el volumen de menos de 5 y# 181; l es poco fiable y un volumen más grande que 10 l conduce a demasiada presión.
8. Una vez que se realiza la inyección, mover el ratón de nuevo a la jaula para recuperarse de la anestesia.
9. Repita este inyección de al menos 2 veces más cada 24 horas para lograr una óptima regulación a la baja del gen diana.

Resultados

Con el fin de ilustrar una inyección de éxito, se realizó esta técnica usando Fast tinte verde FCF en ratones adultos C57Bl6 (8-10 semanas de edad). El animal se le permitió recuperarse durante unos minutos después de la inyección para dar tiempo suficiente para que el tinte se extendió y luego mató con una sobredosis de CO _2. Posteriormente, la columna de la vertebrado fue disecada y la médula espinal se expuso. El puntos lagrimales azul correspondiente al colorante difusa, marcó el sitio de la in...

Discusión

Por lo tanto, la técnica de inyecciones intratecales de aguja anteriormente descrito es eficaz, rápido, específicamente localizada-, y no destructiva. Técnicamente, el aspecto más crítico de este procedimiento es el punto de inserción de la aguja en el surco. Es crucial que este procedimiento se realiza con las manos muy tranquilas y paciencia. Como muchos procedimientos quirúrgicos, la formación mejora la tasa de éxito de la inyección. Esto también es importante porque durante un experimento real, esta téc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
In Vivo-jetPEI	Polyplus	201-10G
WAVE1 siRNA	Santa Cruz	sc-36832
Control siRNA-A	Santa Cruz	sc-37007
Anti-ß-Tubulin III antibody	Sigma	T2200
Anti-WAVE1 antibody	R&D Systems	AF5514
Fast green dye	Sigma	F-7252
Isoflurane	Baxter
Isoflurane setup	Dräger Lübeck
Shaver	Wella
Hamilton syringe Gastight 1702	Hamilton
30 G 1/2 in 13 mm Needle	BD Microlance	304000
Microscope Leica MS5	Leica
WAVE1 forward primer for qRT-PCR	Sigma		cacagagcctcaggacagg
WAVE1 reversed primer for qRT-PCR	Sigma		cttttcaccaacggcatctt
FastStart Essential DNA Green Master	Roche	6402712001