In Vivo trasfezione di siRNA e Gene Knockdown in Spinal Cord via rapida non invasiva lombare spinale iniezioni nei topi

Riepilogo

Questo rapporto descrive una tecnica semplice e rapida di intratecale ago puntura per una trasfezione di siRNA localizzato nel midollo spinale lombare nel topo sotto breve anestesia leggera durata.

Abstract

Questo rapporto descrive una guida step-by-step per la tecnica di iniezioni ago intratecale acuti in maniera non invasiva, cioè indipendente catetere impianto. La limitazione tecnica di questa tecnica chirurgica consiste nella finezza delle mani. L'iniezione è rapida, soprattutto per un sperimentatore addestrato, e poiché rottura dei tessuti con questa tecnica è minima, iniezioni ripetute sono possibili; reazione peraltro immune agli strumenti stranieri (. Es. catetere) non si verifica, dando così una migliore e più specifica leggere di modulazione del midollo spinale. Dato che l'applicazione della sostanza è in gran parte limitata alla regione bersaglio del midollo spinale, farmaci non devono essere applicati in grandi dosi, e soprattutto effetti indesiderati su altri tessuti, come osservato con una consegna sistematica, potrebbero essere aggirate ^{1, 2.} Inoltre, si combinano questa tecnica con transfezione in vivo di acido nucleico con l'aiuto di polyethylenimine (PEI) reagente ^3, che prevede la versatilità tremenda per studiare le funzioni spinali via la consegna di agenti farmacologici così come gene, RNA, proteine ​​e modulatori.

Introduzione

Il midollo spinale è un centro molto importante in una varietà di processi biologici chiave e funzioni fisiologiche, tra cui l'elaborazione e la trasmissione di dolorose (nocicettivi) ingressi ^4-7. Sono state sviluppate varie tecniche sperimentali per facilitare modulazione farmacologica del midollo spinale, come impianto cronica di cateteri intratecali ^8, microiniezione del midollo spinale, e intratecale ago di iniezione ^9. Ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi, e in funzione del paradigma esperimento una tecnica potrebbe essere più adatto rispetto agli altri. Considerando impianto cronica di cateteri intratecali è facilmente realizzabile in ratto, questo metodo è molto difficile nel topo, dato restrizioni di dimensione. Tasso di successo è molto bassa e deficit motori spesso si verificano a causa della presenza ingombrante di un catetere nello spazio subdurale fortemente confinato nel topo. Inoltre, la consegna a lungo termine di farmaci è resa a causa di frequenti coagulazionedi cronicamente impiantati cateteri. Infine, reazioni immunitarie sono comuni.

Questi problemi possono essere aggirate utilizzando il metodo di iniezione intratecale acuta tramite un ago in assenza di un catetere preimplanted, che permette un facile e anatomicamente limitata applicazione di farmaci e reagenti per midolli spinali di topi. Questo metodo mantiene pienamente i vantaggi della somministrazione intratecale su altri percorsi di consegna sistemici (per esempio orale, endovenosa, intraperitoneale, ecc) come specificità di modulazione spinale, che permette dosaggi ridotti ed effetti collaterali limite, così come la capacità di fornire sostanze non fanno normalmente non attraversa la barriera ematoencefalica in quanto durante l'iniezione intratecale, l'ago viene inserito tra la dura madre e il midollo spinale. Importante, tuttavia, in confronto ad altri metodi di somministrazione intratecale, il metodo di iniezione dell'ago intratecale è la meno invasiva, consentendo numerose applicazioni nelstesso animale senza causare notevoli danni ai tessuti o evocando reazione immunitaria a causa di impianto di materiale estraneo. Tuttavia, esso richiede competenze tecniche per una targeting preciso dell'ago per permettere efficacia.

Qui, dimostriamo visivamente il metodo per raggiungere un tasso ottimale di successo per specificamente rivolti midollo spinale lombare. Il sito di iniezione che viene scelto in questo esperimento è il solco tra L5 e L6 colonna vertebrato, vicino a dove termina il midollo spinale, per minimizzare la possibilità di danneggiare il dorso. Inoltre, dimostriamo l'uso di questa tecnica per abbattere i geni nel midollo spinale con siRNA.

Protocollo

Tutte le procedure di utilizzo di animali erano in conformità con le linee guida etiche stabilite dal Consiglio di amministrazione locale (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Germania).

1. Preparazione di siRNA / PEI Complex

La soluzione complesso siRNA / PEI viene preparato utilizzando le indicazioni del produttore come segue:

1. Soluzione A: Diluire la quantità desiderata di siRNA con acqua sterile (se necessario) fino ad un quarto del volume finale e diluire ulteriormente con soluzione di glucosio al 10% fino a metà del volume di fine. Vortex delicatamente o mescolare pipettando su e giù. La quantità ottimale di siRNA deve essere determinato empiricamente, ma 1 mg siRNA in 10 microlitri soluzione complessa per animale è un buon punto di partenza per l'ottimizzazione.
2. Soluzione B: Diluire il volume necessario di PEI reagente con acqua sterile fino a un quarto del volume finale e diluire ulteriormente con soluzione di glucosio al 10% fino a metà del volume finale. Vortex gente o mescolare pipettando su e giù.
   Nota: la quantità di PEI reagente determina l'equilibrio ionico nel complesso che influenza l'efficienza della trasfezione. Allo stesso modo la quantità ottimale di soluzione di PEI deve essere determinato empiricamente. Nelle nostre mani, la quantità ottimale è di 0.12 ml di soluzione di PEI per 1 mg siRNA.
3. Mescolare la soluzione A con soluzione B tutti in una volta, vortice delicatamente.
4. Incubare la soluzione mista per 15 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso. Questo complesso è stabile per 2 ore a temperatura ambiente e per 24 ore a 4 ° C.

2. Iniezione intratecale

1. Anestetizzare il mouse con il 3% isoflurano, fino a che non mostra segni di riflesso di raddrizzamento. Inoltre, controllare la coda e / o zampa pizzico riflesso per garantire ulteriormente lo stato di anestesia.
2. Radere circa 2 cm ² di pelliccia alla fine posteriore dell'animale vicino alla base della coda per facilitare una migliore visualizzazione durante l'inserimento dell'ago.
3. Posizionare il mouse inun'ogiva di una amministrazione isoflurano proseguito nel corso del procedimento, ridurre l'isoflurano al 1,5%, e coprire gli occhi del mouse con lubrificante occhio.
4. Preparare la soluzione pronta all'uso mista siRNA usando una siringa Hamilton 25 microlitri collegato a un 30 G 0.5 a spillo.
5. Individuare il processo spinoso della L6, che dovrebbe essere il più importante e fissare la colonna vertebrato intorno a questa zona premendo delicatamente.
6. Inserire con cautela l'ago tra la scanalatura di L5 e L6 vertebre e osservare per un colpo di coda come questo segno indica un lancio di successo dell'ago nello spazio intradurale.
   Suggerimento: Utilizzando unghia, si dovrebbe essere in grado di individuare la scanalatura pure.
7. Una volta tail flick si osserva, immediatamente, ma attenzione, fissare la posizione dell'ago con una mano e iniettare il volume desiderato di sostanza con l'altra mano lentamente.
   Suggerimento: un volume compreso tra 5-10 microlitri è ottimale in quanto il volume a meno di 5 &# 181; l è inaffidabile e un maggior volume di 10 microlitri porta a troppa pressione.
8. Una volta eseguita l'iniezione, spostare il mouse torna alla gabbia di recupero dall'anestesia.
9. Ripetere questa iniezione più almeno 2 volte ogni 24 ore per raggiungere down-regulation ottimale del gene bersaglio.

Risultati

Al fine di illustrare una iniezione di successo, abbiamo eseguito questa tecnica usando rapidi colorante verde FCF in adulti C57BL6 topi (8-10 settimane di età). L'animale è stato permesso di recuperare per pochi minuti dopo l'iniezione di fornire tempo sufficiente per il colorante di diffondersi e poi ucciso con una overdose di CO _2. Successivamente, la colonna vertebrato stato dissezionato e il midollo spinale è stato esposto. Il puncta blu corrispondente alla tintura diffusa, ha segnato il sito ...

Discussione

Pertanto, la tecnica di iniezioni intratecale aghi sopra descritta è efficace, veloce, specificamente localizzate, e non distruttivo. Tecnicamente, l'aspetto più critico di questa procedura è il punto di inserimento dell'ago nella scanalatura. E 'fondamentale che questa procedura è fatta con le mani molto calma e pazienza. Come molte procedure chirurgiche, la formazione migliora la velocità di iniezione di successo. Questo è importante anche perché durante un esperimento reale, questa tecnica non forn...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
In Vivo-jetPEI	Polyplus	201-10G
WAVE1 siRNA	Santa Cruz	sc-36832
Control siRNA-A	Santa Cruz	sc-37007
Anti-ß-Tubulin III antibody	Sigma	T2200
Anti-WAVE1 antibody	R&D Systems	AF5514
Fast green dye	Sigma	F-7252
Isoflurane	Baxter
Isoflurane setup	Dräger Lübeck
Shaver	Wella
Hamilton syringe Gastight 1702	Hamilton
30 G 1/2 in 13 mm Needle	BD Microlance	304000
Microscope Leica MS5	Leica
WAVE1 forward primer for qRT-PCR	Sigma		cacagagcctcaggacagg
WAVE1 reversed primer for qRT-PCR	Sigma		cttttcaccaacggcatctt
FastStart Essential DNA Green Master	Roche	6402712001