Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Resumen

La unión de viriones a una superficie es un requisito para la obtención de imágenes de viriones individuales mediante imágenes de fluorescencia de súper resolución o microscopía de fuerza atómica (AFM). Aquí se demuestra un método de preparación de la muestra para la adhesión controlada de viriones a las superficies de vidrio adecuado para su uso en AFM y super-resolución de imágenes de fluorescencia.

Resumen

La inmovilización de viriones a superficies de vidrio es un paso crítico en la proyección de imagen de un solo virión. Aquí presentamos una técnica adoptada de ensayos de imágenes de una sola molécula que permite la adhesión de viriones individuales a superficies de vidrio con especificidad. Esta preparación se basa en injertar la superficie del vidrio con una mezcla de PLL-g-PEG y PLL-g-PEG-Biotina, añadir una capa de avidina, y finalmente crear anclajes de virión a través de la unión de anticuerpos específicos del virus biotinilado. Hemos aplicado esta técnica a través de una gama de experimentos incluyendo la microscopia de la fuerza atómica (AFM) y la proyección de imagen de la fluorescencia de la super-resolución. Este método de preparación de la muestra da como resultado una adhesión de control de los viriones a la superficie.

Introducción

Las interacciones inespecíficas basadas en la carga se utilizan rutinariamente para la adhesión de viriones en microscopía de fuerza atómica^1,2. Estas técnicas funcionan especialmente bien cuando se utilizan en viriones no enredados con cápsides muy rígidas^3-6. Aunque estas técnicas son muy eficaces en la inmovilización de la muestra, no evitan la unión inespecífica de proteínas a la superficie. La unión inespecífica puede crear un problema al intentar obtener imágenes de viriones con AFM y técnicas de fluorescencia de súper resolución que requieren incubaciones de la muestra con varios anticuerpos. Aquí se describe un método de preparación de la muestra para la inmovilización específica de viriones.

Poli(etilenglicol) (PEG) injertado a poli(L-lisina) (PLL) y adsorbido sobre una superficie de vidrio proporciona un bloque significativo para las interacciones electrostáticas de proteínas con vidrio^7. Los ensayos de moléculas individuales que requieren inmovilización de moléculas individuales en superficies de vidrio han aprovechado esta propiedad y la han utilizado para crear una técnica específica de inmovilización de molécula única basada en PEG^8-10. Esta preparación también se utilizó para inmovilizar jaulas de clatrina en la superficie de vidrio^11, así como para crear un recubrimiento homogéneo de fibronectina para el control de la adhesión celular ^12.

Hemos adoptado el método de la preparación de la muestra basado en la adsorción de PLL-g-PEG a las superficies de cristal de metodologías de la proyección de imagen de una sola molécula y lo hemos aplicado a los solos viriones de la proyección de imagen del virus vesicular de la estomatitis (VSV). Estos viriones individuales fueron fotomicadas usando la microscopia de la fuerza atómica (AFM). También se realizaron experimentos similares en perlas funcionalizadas como control. Los viriones también fueron foto fotomicadas por microscopía de fluorescencia de súper resolución si se utilizó un anticuerpo VSV-G etiquetado con Alexa 647 para crear una imagen de la envoltura de viriones individuales. Imágenes fluorescentes de alta resolución utiliza la localización de moléculas individuales para crear una imagen^13-15. La imagen biplanar de fPALM permite la localización de moléculas individuales con 20 nm en plano y 50 nm de resolución a lo largo del eje óptico^15,16. Esta técnica bi-planar fue utilizada para las imágenes fluorescentes de la super-resolución de la imagen presentes en este estudio. Una técnica alternativa que tiene resultados similares es STORM^13,17,18.

Tanto AFM como imágenes fluorescentes de súper resolución de VSV ancladas al vidrio por los procedimientos descritos en este trabajo, mostraron una unión específica de viriones al vidrio con mínimas interacciones inespecíficas^19. Aquí presentamos los protocolos de preparación de muestras para el AFM y experimentos de imágenes fluorescentes de súper resolución. En resumen: Las tapas de vidrio limpio se funcionalizan mediante la adsorber una mezcla de PLL-g-PEG y PLL-g-PEG-biotina. Es típico que esta película delgada esté diseñada para proporcionar entre un 15-25% de biotina funcionalizada en una superficie recubierta. Los cubrebocas se incuban además con avidina tetramérica. Un anticuerpo viral biotinilado entonces se utiliza para crear un sitio de unión único para los viriones. La unión del anticuerpo se puede hacer de dos maneras.

El primer método está optimizado para AFM, sin embargo, sigue siendo adecuado para imágenes de fluorescencia de súper resolución. En este método la superficie recubierta de avidina se trata con anticuerpos biotinilados antes de la adhesión viral. Los viriones inmovilizados se tratan con el anticuerpo etiquetado Alexa 647 para cubrir la envoltura y permitir imágenes de fluorescencia de súper resolución de los viriones.

El segundo método es atacar el virus en solución con el anticuerpo biotinilado y el anticuerpo etiquetado alexa 647 antes de adherir los virus a la superficie tratada con avidina; este método está optimizado para experimentos de imágenes de fluorescencia de súper resolución en los que la recuperación de la envoltura viral es importante. Este método tiene la ventaja de permitir un recubrimiento uniforme de anticuerpos en la superficie viral. El anticuerpo biotinilado se puede mezclar con anticuerpos virales etiquetados alexa 647 en proporciones que permiten suficiente adsorción del virus a la superficie tratada con avidina mientras se mantiene una alta concentración de etiqueta fluorescente en el exterior de la envoltura viral. Estos anticuerpos virales etiquetados con Alexa 647 no están biotinilados y su exceso puede enjuagarse para reducir el ruido de fondo.

Protocolo

1. Preparación química

1. Preparación y almacenamiento de PLL-g-PEG-Biotina y avidina:
   1. Disuelva el polímero PLL-g-PEG-biotina en tampón pbs según las instrucciones del fabricante a una concentración de 1,0 mg/ml.
   2. Alícuota según el tamaño de la cubierta (véase el cuadro 1) y conservar a -80 °C durante un máximo de un año.
2. Preparación y almacenamiento de Avidin/NeutrAvidin
   1. Disuelva el Avidin/NeutrAvidin sin etiquetar en el almacenador intermediario de PBS según las instrucciones del fabricante en una concentración de 1.0 mg/ml.
   2. Alícuota según el tamaño de la cubierta (ver Tabla 1)y almacenar a -20 °C durante un máximo de 3 años.
3. Preparación de muestras de virus: Prepare muestras de virus de acuerdo con la necesidad experimental y el protocolo de laboratorio antes de este ensayo. Utilice el paso 1.3.1 para el método 5A, o 1.3.2 para el método 5B.
   1. Prepare muestras de virus para el método 5A antes de la etapa 2. Utilice muestras virales preparadas dentro de los 1-2 días de la preparación, o alícuota de acuerdo con el tamaño del resbalón de la cubierta (ver Tabla 1)luego congele en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C durante un máximo de un año. Cuando se descongele, use inmediatamente.
   2. Prepare muestras de virus para el método 5B similar a 1.3.1. Descongelar las alícuotas del virus antes de 5B y almacenar a 4 °C no más de 24 horas antes de mezclarlas con anticuerpos.
4. Prepare los anticuerpos biotinilados apropiados para el experimento.

2. Limpieza de cubrebocas en preparación para el tratamiento químico

1. Coloque los cubrebocas en un estante de cubrebocas de teflón de tamaño adecuado que los sostenga en una orientación vertical y sumerjalos en un beaker lleno de alcohol etílico filtrado (0.2 μm) (prueba de 190).
2. Sonicar las tapas en el alcohol etílico filtrado (prueba de 190) durante 30 min.
3. Retire los cubrebocas del alcohol y enjuague los cubrebocas extensivamente con agua ultrapura.
4. Coloque los cubrebocas enjuagados en un estante de teflón limpio separado y un casto lleno de NaOH de 1 M.
5. Sonicar los cubrebocas en el NaOH 1 M durante 30 min.
6. Retire los cubrebocas de NaOH y enjuáguelos extensivamente con agua ultrapura.
7. Seque las cubiertas enjuagadas con una corriente de nitrógeno y colóquelas en un estante de teflón limpio y seco.
8. Inspeccione las cubiertas en busca de cualquier película visible o partículas que permanezcan en la cubierta. Si queda algún material visible, el cubrebocas no se ha limpiado y enjuagado adecuadamente. Si no se limpia correctamente, repita los pasos 2.1-2.7.
9. Limpie las tapas con oxígeno-plasma durante 2 min. Este paso es opcional pero se recomienda.

3. Formación de la capa de película delgada PLL-g-PEG

1. Inmediatamente después de secar en la corriente de nitrógeno (o el plasma de oxígeno opcional), coloque una cubiertalip horizontalmente en una placa de Petri estéril. Pipeteo en el centro de la cubierta una cantidad adecuada de PBS descongelado tamponado PLL-g-PEG-biotina (ver Tabla 1).
2. Coloque otra cubierta limpiada encima del líquido en un método de sándwich. Nótese que este método consiste en hacer que dos cubrebocas incuben sus películas químicas orientando sus "caras activas" tratadas químicamente unas hacia otras, separadas solo por la capa química actual. Asegúrese de que haya suficiente fluido de tal manera que el volumen entre las dos cubiertas esté completamente lleno de líquido, pero que ningún fluido se escape de entre las cubiertas (ver Tabla 1). La "cara activa" en adelante designa caras de cubrebocas que han estado en contacto con el fluido en la configuración del sándwich.
3. Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 45-60 min.
4. Retire la tapa de la placa de Petri y recoja el sándwich con un par de pinzas. Tenga cuidado de no pellizcar el exceso de líquido. Use el pulgar y el dedo índice para pellizcar el sándwich ligeramente y deslice las cubiertas en direcciones opuestas horizontalmente con respecto a la otra, luego separe las dos cubiertas una de la otra sin tocar las caras activas.
5. Enjuague ambas caras activas con agua ultrapura pipeteando 25 ml de agua ultrapura sobre la cara activa 2-4x, y luego seque las cubiertas con una corriente de nitrógeno. Asegúrese de anotar qué caras de cubrebocas están activas.
6. Utilice los cubrebocas inmediatamente, o almacene O / N con el activo boca arriba en una placa de Petri estéril colocada en un ambiente libre de polvo y baja humedad.

4. Mejora de unión de Avidin

1. Coloque una cubierta tratada con PLL-g-PEG con activo boca arriba en una placa de Petri estéril.
2. Pipetear una cantidad adecuada de avidina descongelada en el tampón (preparado en el paso 1.2) en la mitad de la cara activa.
3. Coloque otra cubierta (cara activa hacia abajo) encima del líquido en el método de sándwich. Tenga en cuenta la cara activa de los cubrebocas. Es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido durante la incubación (ver paso 3.2).
4. Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich coverslip e incube en RT durante 25-30 min.
5. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas.
6. Enjuague ambas caras activas con agua ultrapura pipeteando 25 ml de agua ultrapura sobre la cara activa 2-4x y luego seque las cubiertas con una corriente de nitrógeno. Tenga en cuenta la cara activa de los cubrebocas. Utilícese inmediatamente para la siguiente etapa.

NOTA IMPORTANTE: Hay dos métodos distintos para completar la preparación de la muestra dependiendo del tipo de ensayo que el experimento implica. El experimentador debe continuar con la etapa 5A en la que el virus se ancla al vidrio antes de que se agregue cualquier tratamiento adicional con anticuerpos requerido para obtener imágenes de súper resolución. 5B describe un método alternativo para etiquetar el virus en solución antes de anclarlo al vidrio. Los datos representativos en este manuscrito se preparan utilizando 5A. Se debe seleccionar un método apropiado de acuerdo con el tipo de ensayo experimental.

5A. Atado activo del anticuerpo de la cara

1. Inmediatamente después de secar con una corriente de nitrógeno en la etapa 4.6, coloque una cubierta tratada con avidina activa boca arriba en una placa de Petri estéril.
2. Pipetear una cantidad adecuada de anticuerpo biotinilado descongelado en tampón en la mitad de la cara activa (ver Tabla 1).
3. Coloque otra cubierta (cara activa hacia abajo) encima del líquido en un método de sándwich. Tenga en cuenta la cara activa de las cubiertas, es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido para la incubación (ver paso 3.2.).
4. Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 45-60 min.
5. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas.
6. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x, no seque y use inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas.
7. Coloque un cubrebocas de anticuerpos tratados con la cara en una placa de Petri estéril y pipetee una cantidad adecuada de virus descongelado en el tampón en el centro de la cara activa.
8. Coloque otra cubierta (cara activa hacia abajo) encima del líquido en un método de sándwich. Obsévense la cara activa, ya que es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido para la incubación (véase el paso 3.2.).
9. Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 45-60 min.
10. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas.
11. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x. No seque los cubrebocas, en su lugar colóquelos en un estante de teflón y un casto lleno de PBS inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas.
12. Utilice las muestras preparadas inmediatamente o guárdelo en un tampón apropiado a 4 °C durante un máximo de tres días sin pérdida significativa de integridad.
    
    NOTA importante: Si las muestras se van a utilizar en un ensayo de AFM, la preparación está completa y pueden utilizarse inmediatamente o almacenarse como se describe en el paso 5A.20 - 5A.21. Si las muestras se van a utilizar en un ensayo de imágenes de fluorescencia de súper resolución, proceda al etiquetado de anticuerpos descrito en los pasos 5A.12 - 5A.19.
13. Coloque ambos cubrebocas tratadas con virus activos boca arriba en una placa de Petri estéril y pipetee suficiente tampón de bloqueo de proteínas en los cubrebocas para obtener suficiente volumen de líquido para cubrir el 95% central del cubrebocas sin que fluya ningún tampón de bloqueo del cubrebocas (típicamente 100 - 200 μl). Incubar en RT durante 60-90 min.
14. Retire cuidadosamente el tampón de bloqueo eliminando los cubrebocas de uno en uno de la placa de Petri y vertiendo el líquido del cubrebocas en un casto de residuos. Tenga cuidado de no dejar caer el cubrebocas.
15. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x, no seque y use inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas.
16. Coloque un solo tampón de bloqueo tratado con cubrebocas activo boca arriba en una placa de Petri estéril, y pipetee una cantidad adecuada de anticuerpo viral marcado fluorescentemente en el tampón en el centro de la cara activa.
17. Coloque otra tapa (cara activa hacia abajo) encima del líquido en un método de sándwich. Tenga en cuenta qué cara está activa, es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido para la incubación (ver paso 3.2).
18. Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 30 min.
19. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas.
20. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x, no seque y use inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas.
21. No seque los cubrebocas, sino que colóquelos en un estante de teflón dentro de un beaker lleno de PBS. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas.
22. Utilice las muestras preparadas inmediatamente o guárdelo en un tampón apropiado a 4 °C durante un máximo de tres días sin pérdida significativa de integridad.

5B. Ataque de anticuerpos en solución

Este método es una mejora opcional de la estrategia de etiquetado para la proyección de imagen fluorescente de la super-resolución. Mediante la aplicación del ataque en solución, se puede lograr un mejor recubrimiento de anticuerpos en la superficie viral.

1. Mezclar soluciones de anticuerpos en proporciones de acuerdo con la necesidad de experimentos. La proporción del ejemplo 1:4 de 0,01 mg/ml de anticuerpos biotinilados a 0,01 mg/ml de anticuerpos marcados con fluorescente dará una buena afinidad de unión y permitirá una buena recuperación de la envoltura en un ensayo de imágenes de súper resolución.
2. Mezclar porciones iguales de las soluciones de anticuerpos y virus preparadas respectivamente en (5B.1) y (1.3). Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo un par de veces en la alícuota. Esta solución resultante se puede almacenar hasta que sea necesario durante un hasta 24 horas a 4 °C.
3. Al finalizar el paso 4.6, coloque una cubierta tratada con avidina con activa boca arriba en una placa de Petri estéril.
4. Pipetear una cantidad adecuada de virus con solución de anticuerpos (preparada en el paso 5B.2) en la mitad de la cara activa.
5. Coloque otra cubierta (cara activa hacia abajo) encima del líquido en un método de sándwich. Tenga en cuenta la cara activa, ya que es importante que las caras activas estén en contacto con el líquido para la incubación (ver paso 3.2).
6. Coloque la tapa de la placa de Petri sobre el sándwich de cubrebocas e incube en RT durante 45-60 min.
7. Retire la tapa de la placa de Petri y separe las dos cubiertas como se describe en el paso 3.4, asegurándose de realizar un seguimiento y no tocar las caras activas.
8. Enjuague ambas caras activas con PBS pipeteando 25 ml de PBS sobre la cara activa 2-4x. No seque los cubrebocas, en su lugar colóquelos en un estante de teflón y un casto lleno de PBS inmediatamente. Asegúrese de realizar un seguimiento de qué caras de cubrebocas están activas.
9. Utilice las muestras preparadas inmediatamente o guárdelo a 4 °C durante un máximo de tres días sin pérdida significativa de integridad.

6. Medición de la propiedad del material de microscopía de fuerza atómica

1. Encienda los láseres AFM y abra el software AFM. Seleccione el modo de escaneo apropiado para el ensayo deseado en el cuadro de diálogo de apertura. Todas las ventanas necesarias deben abrirse de forma predeterminada; si no consulta el manual de usuario para abrir las ventanas deseadas.
2. Seleccione un voladizo apropiado para la medición deseada e insértelo en la carcasa del voladizo de acuerdo con las directrices del fabricante. Hay una amplia gama de condiciones y tipos de experimentos para los que hay una variedad de voladizos. El experimentador debe investigar voladizos de acuerdo a su necesidad.
3. Inserte la carcasa en voladizo en el cabezal AFM de acuerdo con las directrices del fabricante.
4. Si la muestra se va a utilizar en condiciones húmedas, retire la muestra del búfer de almacenamiento y continúe con el paso 6.7.
5. Si la muestra se va a utilizar en condiciones ambientales (secas), retire la muestra de su tampón de almacenamiento y enjuáguela brevemente sumergiendo en un castor de agua ultrapura. Nota: Esto dejará una capa de hidratación delgada en la muestra que puede inducir atracción capilar con voladizos que tienen una constante de resorte bajo.
6. Si la muestra se va a utilizar en condiciones ambientales (secas), seque suavemente la muestra con una corriente de nitrógeno.
7. Seque suavemente la parte posterior de la tapa con un papel de filtro libre de polvo, asegurándose de no tocar la cara activa de la muestra.
8. Coloque la muestra en el soporte de muestra AFM apropiado, luego coloque la muestra en la etapa AFM.
9. Si la muestra se va a tomar una imagen en condiciones húmedas, pipetee una pequeña cantidad de tampón en el centro de la muestra (~ 10 μl).
10. Coloque el cabezal AFM sobre la muestra.
11. Si la muestra está húmeda, asegúrese de que el voladizo y la punta AFM penetren en la capa superficial y que no haya burbujas entre la carcasa en voladizo y en voladizo.
12. Alinee el láser AFM con el voladizo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para obtener la señal óptima.
13. Mida la frecuencia resonante en voladizo y establezca la frecuencia de exploración según el tipo de experimento.
14. Baje la punta AFM a la superficie y optimice la configuración de la señal.
15. Realice un escaneo AFM cuadrado de 20 μm en el modo que elija. Se utilizó el modo Tapping (AC) para generar datos representativos. Identifique a los candidatos a virus por una altura aproximada, que normalmente se puede ver como picos agudos en la superficie del vidrio.
16. Seleccione un candidato a virus y centre el cabezal de escaneo encima de él.
17. Realice una exploración cuadrada de 250 nanómetro (o una exploración apropiada de la super-resolución) sobre el virus seleccionado para obtener su topología y orientación.
18. Seleccione un punto en el virus para la medición de la propiedad del material(por ejemplo, el centro de un virus esférico para la medición del módulo de Young) y realice la medición de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7. Método de imágenes de súper resolución

1. Abra el software de imágenes de súper resolución y calibre el software de acuerdo con las directrices del fabricante.
2. Calibre el equipo de imágenes de súper resolución de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando perlas fluorescentes.
3. Monte el tampón de imágenes de muestras de las existencias justo antes de la toma de imágenes combinando 50 μl de 1 M MEA y 100 μl de 10x Gloxy a 850 μl de tampón de stock. Mantenga el tampón de imágenes en el hielo durante la duración del experimento.
4. Retire un cubrebocas preparado con muestra de su tampón de almacenamiento y enjuáguelo 5x sumergiéndolo en un castor de agua ultrapura.
5. Seque la cara de la cubierta no activa utilizando un papel de filtro libre de polvo. Asegúrese de no tocar la cara activa.
6. Inserte en un soporte de muestra del sistema de imágenes y agregue 250 μl de tampón de imágenes al soporte de la muestra. Es razonable intercambiar el tampón de imágenes en la muestra cada 2 horas para mantener resultados consistentes.
7. Cubra el soporte de la muestra con parafilm para disminuir la interacción atmosférica con el entorno de la habitación.
8. Coloque el soporte de la muestra en el equipo de imágenes para la toma de imágenes.
9. Ponga la muestra en foco utilizando las instrucciones del fabricante.
10. Imagen de la muestra de acuerdo con la técnica de super-resolución que se está empleando. Asegúrese de ajustar las condiciones de imagen para optimizar la señal mientras disminuye las activaciones simultáneas de fluoróforos foto-conmutables.
    
    NOTA IMPORTANTE: Las condiciones de la proyección de imagen son dependientes de la muestra y varían según necesidad experimental. Un experimento típico que utiliza Alexa 647 inicializada de manera eficiente en su estado oscuro en el búfer de imágenes puede ser fotoactivo a través de la aplicación de luz UV de 405 nm. Las imágenes se obtienen excitando un subconjunto escaso de moléculas de Alexa 647 dentro de una muestra densamente etiquetada y localizando cada fluoróforo con una precisión limitada principalmente por el número de fotones recogidos. Este procedimiento es iterado repetidamente por el software hasta que se ha producido un número deseado de ciclos de adquisición. El experimentador debe hacer que este ajuste se correlacione con cada fluoróforo de la muestra que ha sido fotoblanqueado.
11. Cuando se complete la toma de imágenes, apague el equipo de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El software puede dejarse abierto para el análisis de datos.
12. El análisis de datos depende en gran medida del experimento; sin embargo, en todos los casos identificar los virus por su ancho completo a la mitad máximo, que se compara con las dimensiones conocidas del virus, asegurándose de tener en cuenta el tamaño adicional de las etiquetas fluorescentes.
13. Para una mejor visualización, vea las muestras utilizando la opción de representación de isosuperficie o la opción de representación volumétrica, que normalmente se encuentran en el software de imágenes de súper resolución.

Resultados

Imágenes de virión único usando AFM:

El protocolo de preparación de muestras descrito anteriormente se utilizó en el anclaje de viriones de tipo salvaje a la superficie de vidrio. Los viriones VSV tienen forma de bala de 180 nm de longitud y 80 nm de diámetro. Como hay una variedad de viriones para los que se puede aplicar esta técnica, el concepto también se demuestra aquí en perlas biotiniladas de 36 nm también. Los experimentos AFM resultantes se muestran en la Figura 1. Es importante tener en cuenta que los viriones VSV tienen un módulo de Young más bajo (100 MPa) en comparación con los virus no envopados (GPa). Las imágenes particulares de un solo virión VSV se obtuvieron en modo de tapping en condiciones ambientales con un voladizo rígido. El objetivo ha sido deformar el virus hasta el punto de que la densidad de proteínas adicionales dentro del virus se hace visible como una protuberancia dentro de la imagen AFM. Este método se utiliza para detectar la densidad extra de proteínas dentro de la cavidad del virus¹⁹.

Imágenes de super resolución de virión único:

Alexa 647 etiquetado VSV-G anticuerpos se utilizaron para recubrir la envoltura de viriones VSV individuales para experimentos de súper resolución utilizando el método 5A. Para demostrar la densidad de ataduras y la baja unión inespecífica, se muestra un escaneo grande de la muestra en la Figura 2A. La recuperación de la envoltura viral en un virión representativo se muestra en la Figura 2B (isosuperficie azul).

Figura 1. Proyección de imagen de AFM de cuentas y de VSV en la superficie funcionalizada de PEGG. Exploración de AFM de los granos biotinylated de 36 nanómetro(A, B)y de un virion de VSV(c)anclado a la superficie con un anticuerpo biotinylated de VSVG. AFM se realizó en modo de exploración de topografía de aire ac. El radio de la punta es de <25 nm y las mediciones se llevaron a cabo bajo modulación de fuerza y golpecito de luz. La punta tenía una constante de fuerza de 3 N/m y una frecuencia resonante de 75 kHz con una incertidumbre de 15 kHz. Mientras que las perlas conservaron su altura durante la exploración AFM, el virión VSV tiene un módulo de jóvenes significativamente más pequeño y está significativamente deformado en altura. En esta imagen, el virión fue fotoficado específicamente con un voladizo rígido en modo tapping que produjo una pequeña convolución xy (utilizada para determinar la punta vs extremo romo del virus) y la diferencia de altura entre la punta y el extremo romo del virus se utiliza para detectar densidad de proteínas adicionales en el extremo romo del virus¹⁹.

Figura 2. Fluorescencia basada en imágenes de viriones VSV en la superficie funcionalizada PEGG. A)viriones recombinantes de VSV inmovilizados en la superficie de PEGG utilizando un anticuerpo anti VSVG biotinilado fotoizado en fluorescencia de amplio campo. B)Reconstrucción de fluorescencia de alta resolución de la envoltura de VSV unida a la superficie de PEGG a través de un anticuerpo anti VSVG biotinilado y decorado con anticuerpos anti-VSVG etiquetados con Alexa 647 (se utilizó el Método 5A para la creación de estas imágenes). La superficie azul es una proyección isosuperficial 2D. La izquierda muestra un modelo del virus en forma de bala. 

Tamaño de la la ficha de cubierta	fluido
40 milímetros	65 μl
35 milímetros	50 μl
30 milímetros	36 μl
25 milímetros	25 μl
20 milímetros	16 μl

Tabla 1. Alícuotas fluidas según el tamaño del cubrecubos.

Discusión

La proyección de imagen del solo virión con AFM y proyección de imagen de alta resolución de la fluorescencia se puede utilizar como metodología alternativa a la tomografía de CryoEM. Cada una de estas metodologías tiene sus fortalezas específicas. Por ejemplo, AFM se puede hacer en viriones WT sin necesidad de etiquetar la muestra o las proteínas virales internas. La localización de las estructuras virales se desconvía de sus contribuciones a las propiedades elásticas del virión.

Las imágenes de super-resolución de virión único en combinación con los enfoques genéticos inversos virales recientemente desarrollados se convierten en una técnica poderosa para localizar proteínas virales de bajo número de copias²⁰. Los virus recombinantes con el reemplazo de sus proteínas con las proteínas fundidas a las proteínas fluorescentes se pueden hacer y purificar usando estos acercamientos genéticos reversos. Aunque las imágenes de súper resolución tienen especificidad en parte debido al etiquetado genético, requiere el uso de los virus mutantes.

AFM y la proyección de imagen de la super-resolución son los métodos complementarios que utilizan preparaciones muy similares de la muestra. Los métodos descritos en este documento, que se adoptan forman ensayos anteriores de imágenes de molécula única, permiten el anclaje de viriones individuales con pocos efectos sobre la topología de los viriones.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass coverslips (fPALM)	Electron Microscopy Services	72225-01	25 mm Coverslips
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)	SuSoS	-	Stock: 0.5 mg/ml in PBS
NeutrAvidin biotin-binding protein	Invitrogen	A2666	Stock: 0.25 mg/ml in PBS
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21245	1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer
α-VSV-G	Invitrogen	ab34774	1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer
Gluox	Sigma	G2133-250KU	Glucose oxidase type seven from Aspergillius
Catalase	Sigma	C40-100mg	Catalase from Bovine liver
MEA	Sigma	30070-10G	Cysteamine (MEA
Stock Buffer			50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose
NTE			10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA
Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit	Thermo Scientific		10,000 MW
Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1	Fisherbrand	35 CIRCLE #1