Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения

Резюме

Пристройка вирионов к поверхности является обязательным условием для одной вирионной визуализации с помощью флуоресцентной визуализации суперпозвания или атомной силовой микроскопии (AFM). Здесь мы демонстрируем метод подготовки образца для контролируемого прикрас виньонов к стеклянным поверхностям, пригодным для использования в AFM и флуоресценции супер-разрешения.

Аннотация

Иммобилизация вирионов на стеклянные поверхности является важным шагом в одной вирионной визуализации. Здесь мы представляем методику, основанную на анализах изображений одной молекулы, которая позволяет с специфичностью присвежесть одиночные вировы к стеклянным поверхностям. Этот препарат основан на прививке поверхности стекла смесью PLL-g-PEG и PLL-g-PEG-Biotin, добавляя слой алдин, и, наконец, создавая якоря вириона через вложение биотинилированных специфических антител вируса. Мы применили этот метод в различных экспериментах, включая атомную силовую микроскопию (AFM) и флуоресценцию супер-разрешения. Этот метод подготовки образца приводит к борьбе с притяговкой виньонов на поверхность.

Введение

Зарядка на основе неспецифических взаимодействий обычно используется для приобщения виньонов в атомной силовой^{микроскопии 1,2.} Эти методы особенно хорошо работают при использовании на неуроногих вирионов с очень жесткой^{капсиды 3-6}. Хотя эти методы очень эффективны в обездвиживания образца, они не препятствуют неспецифической привязки белков к поверхности. Неспецифическая привязка может создать проблему при попытке изображения вирионов с AFM и супер-разрешение флуоресценции методы, которые требуют инкубации образца с различными антителами. Здесь мы наметим метод подготовки образца для специфической иммобилизации виньонов.

Поли (этиленгликоль) (PEG), привитый поли (L-лизин) (PLL) и адсорбирован на стеклянную поверхность, обеспечивает значительный блок для электростатических взаимодействий белков со стеклом⁷. Одноявекулярные анализы, требующие иммобилизации отдельных молекул на стеклянных поверхностях, воспользовались этим свойством и использовали его для создания специфической техники иммобилизации одной молекулы на основе PEG^8-10. Этот препарат был также использован для обездвиживания клеток клатрина^{на поверхности стекла 11,} а также создание однородного фибронектина покрытие для управления клеточной адгезии ¹².

Мы приняли метод подготовки образца на основе PLL-g-PEG adorption к стеклянным поверхностям из одной молекулы визуализации методологии и применил его для визуализации одного virions вируса везикулярного стоматита (VSV). Эти одиночные виньоны были изображены с помощью атомной микроскопии силы (AFM). Аналогичные эксперименты проводились и на функционализированных бусинках в качестве контроля. Виньоны были также изображены супер-разрешение флуоресценции микроскопии были VSV-G антитела помечены Alexa 647 был использован для создания изображения конверта одного virions. Высокое разрешение флуоресцентной визуализации использует локализацию отдельных молекул для создания^{изображения 13-15}. двухпланарная визуализация fPALM позволяет локализации отдельных молекул с разрешением 20 нм в плоскости и разрешением 50^{нм вдоль оптической оси 15,16}. Этот двухплановый метод был использован для изображения флуоресцентных изображений супер-разрешения, присутствующих в этом исследовании. Альтернативный метод, который имеет аналогичные результаты STORM^13,17,18.

И AFM и супер-разрешение флуоресцентные изображения VSV закреплены на стекле процедур, изложенных в этой работе, показали конкретные привязки виньонов к стеклу с минимальными неспецифическими^{взаимодействиями 19}. Здесь мы представляем протоколы подготовки образцов для экспериментов AFM и супер-разрешения флуоресцентных изображений. Короче говоря: Чистые стеклянные крышки функционируют путем адсорбирования смеси PLL-g-PEG и PLL-g-PEG-биотина. Это типично для этой тонкой пленки, которая будет разработана, чтобы обеспечить между 15-25% функционализированного биотина на покрытой поверхностью. Крышки дополнительно инкубируется тетрамерическим алдином. Биотинилированные вирусные антитела затем используется для создания уникального сайта связывания для виритов. Связывание антител может быть сделано двумя способами.

Первый метод оптимизирован для AFM, однако он остается пригодным для визуализации флуоресценции супер-разрешения. В этом методе avidin покрытием поверхности рассматривается с биотинилированным антителом до вирусной адгезии. Обездвиженные виньоны обрабатываются антителами Alexa 647 с маркировкой, чтобы покрыть оболочку и позволить супер-разрешение флуоресценции изображения виньонов.

Второй метод заключается в атаке вируса в растворе с биотинилированным антителом и Alexa 647 помечены антитела до прилипния вирусов к avidin обработанной поверхности; этот метод оптимизирован для экспериментов по визуализации флуоресценции супер-разрешения, в которых важно восстановление вирусного конверта. Этот метод имеет то преимущество, что позволяет равномерное покрытие антител на вирусной поверхности. Биотинилированные антитела могут быть смешаны с Alexa 647 помечены вирусные антитела в соотношении, которые позволяют достаточно adorption вируса к avidin обработанной поверхности при сохранении высокой концентрации флуоресцентной этикетки на внешней стороне вирусной оболочки. Эти Alexa 647 помечены вирусные антитела не биотинилированные и их избыток может быть промыть прочь для того, чтобы уменьшить фоновый шум.

протокол

1. Химия Подготовка

1. Подготовка и хранение PLL-g-PEG-биотина и алдин:
   1. Растворите полимер PLL-g-PEG-биотин в буфере PBS в соответствии с указаниями производителя при концентрации 1,0 мг/мл.
   2. Aliquot в соответствии с размером крышки (см. таблицу 1) и хранить при -80 градусов по Цельсию на срок до одного года.
2. Подготовка и хранение Avidin/NeutrAvidin
   1. Растворите неотсвятный Avidin/NeutrAvidin в буфере PBS в соответствии с указаниями производителя при концентрации 1,0 мг/мл.
   2. Aliquot в соответствии с размером крышки (см. таблицу 1) и хранить при -20 градусов по Цельсию на срок до 3 лет.
3. Подготовка образца вируса: Подготовка образцов вируса в соответствии с экспериментальной потребностью и лабораторным протоколом до этого анализа. Используйте шаг 1.3.1 для метода 5A, или 1.3.2 для метода 5B.
   1. Подготовка образцов вируса для метода 5A до 2-го этапа. Используйте подготовленные вирусные образцы в течение 1-2 дней после приготовления, или aliquot в соответствии с размером покрытия скольжения (см. таблицу 1), затем вспышки заморозить в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Цельсию на срок до одного года. Когда оттаяет, немедленно используйте.
   2. Подготовка образцов вируса для метода 5B, аналогичного 1.3.1. Оттепель aliquots вируса до 5B и хранить при 4 КК не более 24 часов до смешивания с антителами.
4. Подготовье соответствующих биотинилированных антител для эксперимента.

2. Очистка крышки в рамках подготовки к химической обработке

1. Поместите крышки в соответствующую по размеру стойку тефлонового покрытия, которая удерживает их в вертикальной ориентации и погружает в стакан, наполненный фильтрованным (0,2 мкм) этилового спирта (190 доказательств).
2. Sonicate coverslips в фильтрованного этилового спирта (190 доказательство) в течение 30 мин.
3. Удалить coverslips от алкоголя и промыть coverslips широко с ультрачистой водой.
4. Поместите промытые крышки в отдельную чистую тефлоновую стойку и стакан, наполненный 1 M NaOH.
5. Sonicate крышки в 1 M NaOH в течение 30 мин.
6. Удалите крышки из NaOH и широко промойте их ультрачистой водой.
7. Высушите промытые крышки азотным потоком и поместите их в чистую сухую тефлоновую стойку.
8. Осмотрите крышки для любой видимой пленки или частиц, которые остаются на крышке. Если какой-либо видимый материал остается, крышки не были должным образом очищены и промыты. Если не правильно очистить повторные шаги 2.1-2.7.
9. Очистите крышки кислородно-плазмой в течение 2 мин. Этот шаг является необязательным, но рекомендуется.

3. Формирование тонкого слоя пленки PLL-g-PEG

1. Сразу после высыхания в потоке азота (или дополнительной кислородно-плазменной), поместите один крышку горизонтально в стерильную чашку Петри. Pipet в центре крышки соответствующее количество оттаялого PBS буферных PLL-g-PEG-биотин (см. таблицу 1).
2. Поместите еще один очищенный крышки на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание, что этот метод состоит из двух coverslips инкубировать свои химические пленки, ориентируя их химически обработанных "активных лиц" друг к другу, разделенных только текущим химическим слоем. Убедитесь, что существует достаточно жидкости, так что объем между двумя крышками полностью заполнен жидкостью, но что нет утечки жидкости между крышками (см. таблицу 1). "Активное лицо" отныне обозначает крышки лица, которые были в контакте с жидкостью в конфигурации бутерброда.
3. Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 45-60 мин.
4. Снимите крышку чашки Петри и возьмите бутерброд с парой пинцетов. Будьте осторожны, чтобы не ущипнуть избыток жидкости. Используйте большой и указательный пальцы, чтобы слегка ущипнуть сэндвич и сдвиньте крышки в противоположных направлениях горизонтально по отношению друг к другу, а затем отделить две крышки друг от друга, не касаясь активных лиц.
5. Промыть оба активных лица с ультрачистой водой путем трубопроводов 25 мл ультрапурной воды над активным лицом 2-4x, а затем высушить крышки с потоком азота. Не забудьте отметить, какие лица обложки активны.
6. Используйте крышки немедленно, или хранить O / N с активным лицом вверх в стерильной чашке Петри помещены в свободной от пыли низкой влажности окружающей среды.

4. Avidin Связывание Повышение

1. Поместите обработанный крышку PLL-g-PEG с активным лицом вверх в стерильную чашку Петри.
2. Pipette соответствующее количество разморожевания avidin в буфере (подготовлен в шаге 1.2) на середину активного лица.
3. Поместите другой крышку (активное лицо вниз) на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание на активное лицо крышки. Важно, чтобы активные лица соего контакта с жидкостью во время инкубации (см. шаг 3.2).
4. Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать в RT в течение 25-30 мин.
5. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам.
6. Промыть оба активных лица с ультрапурной водой, трубя 25 мл ультрапурной воды над активным лицом 2-4x, а затем высушить крышки с потоком азота. Обратите внимание на активное лицо крышки. Используйте немедленно для следующего этапа.

IMPORTANT ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют два различных метода для завершения подготовки образца в зависимости от типа анализа эксперимента влечет за собой. Экспериментатор должен приступить к этапу 5A, в котором вирус закреплен на стекле, прежде чем какие-либо дополнительные антитела лечения, необходимые для супер-разрешение изображения добавляется. 5B описывает альтернативный метод маркировки вируса в растворе, прежде чем присев его на стекло. Репрезентативные данные в этой рукописи готовятся с использованием 5A. Соответствующий метод должен быть выбран в соответствии с экспериментальным типом анализа.

5A. Активный антитела лица Tether

1. Сразу после высыхания азотным потоком на стадии 4.6 поместите алдин обработанный крышку активным лицом вверх в стерильную чашку Петри.
2. Pipette соответствующее количество оттаялого биотинилированного антитела в буфере на середину активного лица (см. таблицу 1).
3. Поместите другой крышку (активное лицо вниз) на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание на активное лицо крышки, важно, чтобы активные лица находятся в контакте с жидкостью для инкубации (см. шаг 3.2.).
4. Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 45-60 мин.
5. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам.
6. Промыть оба активных лица с PBS путем пипетки 25 мл PBS над активным лицом 2-4x, не высыхают и использовать немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны.
7. Поместите антитела лечение coverslip активное лицо в стерильной чашке Петри, и пипетки соответствующее количество оттаялого вируса в буфер на середину активного лица.
8. Поместите другой крышку (активное лицо вниз) на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание на активное лицо, так как важно, чтобы активные лица со контактом с жидкостью для инкубации (см. шаг 3.2.).
9. Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 45-60 мин.
10. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам.
11. Промыть оба активных лица с PBS путем трубопроводов 25 мл PBS над активным лицом 2-4x. Не сушите крышки, вместо этого поместите их в тефлоновую стойку и стакан, наполненный PBS немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны.
12. Немедленно используйте подготовленные образцы или храните в соответствующем буфере при 4 градусах Цельсия в течение трех дней без существенной потери целостности.
    
    Важное ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы должны быть использованы в анализе AFM, подготовка завершена, и они могут быть использованы немедленно или храниться, как описано в шаге 5A.20 - 5A.21. Если образцы должны быть использованы в анализе флуоресценции супер-разрешения, переходите к маркировке антител, описанной в шагах 5A.12 - 5A.19.
13. Поместите оба вируса обработанные coverlips активное лицо вверх в стерильной чашке Петри и пипетки достаточно белка блокирования буфера на coverslips шарик достаточно жидкости объем для покрытия центральной 95% крышки без течет любой блокирующий буфер от крышки (как правило, 100 - 200 l.) Инкубация на RT в течение 60-90 мин.
14. Аккуратно удалите блокирующий буфер, удалив крышки по одному из чашки Петри и вылив жидкость из крышки в стакан отходов. Будьте осторожны, чтобы не уронить крышку.
15. Промыть оба активных лица с PBS путем пипетки 25 мл PBS над активным лицом 2-4x, не высыхают и использовать немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны.
16. Поместите один блокирующий буфер обработанных coverslip активное лицо в стерильной чашке Петри, и пипетка соответствующее количество флуоресцентно помечены вирусные антитела в буфере на середину активного лица.
17. Поместите другой крышкой (активное лицо вниз) сверху жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание, какое лицо активно, важно, чтобы активные лица находятся в контакте с жидкостью для инкубации (см. шаг 3.2).
18. Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 30 минут.
19. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам.
20. Промыть оба активных лица с PBS путем пипетки 25 мл PBS над активным лицом 2-4x, не высыхают и использовать немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны.
21. Не сушите крышки, вместо этого поместите их в тефлоновую стойку в стакане, наполненном PBS. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны.
22. Немедленно используйте подготовленные образцы или храните в соответствующем буфере при 4 градусах Цельсия в течение трех дней без существенной потери целостности.

5Б. В атаке антител решения

Этот метод является необязательным усовершенствование стратегии маркировки для супер-разрешения флуоресцентных изображений. Применяя при атаке раствора, лучшее покрытие антител на вирусной поверхности может быть достигнуто.

1. Смешайте антитела решений в соотношении в соответствии с экспериментами нужно. Пример 1:4 соотношение 0,01 мг/мл биотинилированных антител к 0,01 мг/мл флуоресцентно помеченных антител даст хорошее связывающее сродство и позволит хорошее восстановление конверта в супер-разрешение изображения анализа.
2. Смешайте равные части антител и вирусных растворов, соответственно, подготовленных в (5B.1) и (1.3). Смешайте осторожно, трубя вверх и вниз несколько раз в aliquot. Это в результате раствор может храниться до тех пор, пока это необходимо для до 24 часов при 4 градусов по Цельсию.
3. По завершении шага 4.6, поместите avidin обработанные крышки с активным лицом вверх в стерильной чашке Петри.
4. Pipette соответствующее количество вируса с антителом раствор (подготовлен в шаге 5B.2) на середину активного лица.
5. Поместите другой крышку (активное лицо вниз) на вершине жидкости в сэндвич метод. Обратите внимание на активное лицо, так как важно, чтобы активные лица со контактом с жидкостью для инкубации (см. шаг 3.2).
6. Поместите крышку чашки Петри на сэндвич с крышкой и инкубировать на RT в течение 45-60 мин.
7. Снимите крышку чашки Петри и разделте две крышки, описанные в шаге 3.4, убедившись, что отслеживать и не прикасаться к активным лицам.
8. Промыть оба активных лица с PBS путем трубопроводов 25 мл PBS над активным лицом 2-4x. Не сушите крышки, вместо этого поместите их в тефлоновую стойку и стакан, наполненный PBS немедленно. Обязательно следите за тем, какие лица обложки активны.
9. Используйте подготовленные образцы немедленно или храните при 4 градусах Цельсия в течение трех дней без значительной потери целостности.

6. Измерение свойства материалов атомной микроскопии силы

1. Включите лазеры AFM и откройте программное обеспечение AFM. Выберите подходящий режим сканирования для желаемого анализа из диалога открытия. Все необходимые окна должны открываться по умолчанию; если не проконсультируйтесь с руководством пользователя, чтобы открыть нужные окна.
2. Выберите кантилевер, соответствующий желаемому измерению, и вставьте его в корпус кантилевера в соответствии с руководящими принципами производителя. Существует широкий спектр условий и типов экспериментов, для которых существуют различные кантилеверы. Экспериментатор должен исследовать кантилеверы в соответствии с их потребностью.
3. Вставьте корпус кантилевера в голову AFM в соответствии с руководящими принципами производителя.
4. Если образец будет использоваться во влажных условиях, удалите образец из буфера хранения и перейти к шагу 6.7.
5. Если образец будет использоваться в условиях окружающей среды (сухой), удалите образец из буфера хранения и прополощите его, окунув в стакан ультрачистой воды. Примечание: Это оставит тонкий слой гидратации на образец, который может вызвать притяжение капилляров с кантилеверами, имеющих низкую пружинную константу.
6. Если образец будет использоваться в окружающей (сухой) условиях, аккуратно высушите образец потоком азота.
7. Аккуратно высушите заднюю сторону крышки с помощью фильтровальной бумаги без пыли, чтобы не касаться активного лица образца.
8. Поместите образец в соответствующий держатель образца AFM, а затем поместите образец на сцену AFM.
9. Если образец будет изображен во влажных условиях, пипетка небольшое количество буфера на центр образца (No 10 мкл).
10. Поместите головку AFM над образцом.
11. Если образец мокрый, убедитесь, что кантилевер и наконечник AFM проникают в поверхностный слой, и что между кантилевером и кантилевером нет пузырьков.
12. Выравнивание лазера AFM с кантилевером в соответствии с рекомендациями производителя для получения оптимального сигнала.
13. Измерьте резонансную частоту кантилевера и установите частоту сканирования в соответствии с типом эксперимента.
14. Опустите наконечник AFM на поверхность и оптимизируйте настройки сигнала.
15. Выполните сканирование AFM площадью 20 мкм в режиме по вашему выбору. Режим нажатия (ПЕРЕМЕН) использовался при генерации репрезентативных данных. Определите кандидатов вируса по приблизительной высоте, которую обычно можно рассматривать как резкие шипы на поверхности стекла.
16. Выберите кандидата от вируса и центр сканирования голову над ним.
17. Выполните сканирование квадрата 250 нм (или соответствующее сканирование супер-разрешения) о выбранном вирусе, чтобы получить его топологию и ориентацию.
18. Выберите точку на вирусе для измерения свойств материала(например, центр сферического вируса для измерения модула Янга) и выполните измерение в соответствии с указаниями производителя.

7. Метод визуализации супер-разрешения

1. Откройте программное обеспечение для визуализации с супер-разрешением и откалибровайте программное обеспечение в соответствии с руководящими принципами производителя.
2. Калибруйте оборудование для визуализации супер-разрешения в соответствии с указаниями производителя с использованием флуоресцентных бусин.
3. Соберите буфер визуализации образца из запасов непосредственно перед визуализацией, объединив 50 мкл 1 М МЕА и 100 мкл 10x Gloxy до 850 мл запасного буфера. Храните буфер изображения на льду в течение всего эксперимента.
4. Удалите подготовленный крышку с образцом из буфера хранения и промойте его 5x, окунув его в стакан ультрачистой воды.
5. Высушите неактивное лицо крышки, используя фильтровальную бумагу без пыли. Убедитесь в том, чтобы не прикасаться к активному лицу.
6. Вставьте в держатель образца системы визуализации и добавьте 250 мкл буфера изображения к держателю образца. Разумно обмениваться буфером изображения на выборке каждые 2 часа для поддержания последовательных результатов.
7. Обложка образца держателя с парафильмом для уменьшения атмосферного взаимодействия с комнатной средой.
8. Поместите держатель образца в оборудование для визуализации.
9. Сосредоточьте образец, используя направления производителя.
10. Изображение образца в соответствии с используемой техникой супер-разрешения. Обязательно отрегулируйте условия визуализации для оптимизации сигнала при одновременном снижении одновременной активации фотоизменяемых флюорофоров.
    
    IMPORTANT ПРИМЕЧАНИЕ: Условия визуализации зависят от образца и варьируются в зависимости от экспериментальной необходимости. Типичный эксперимент с использованием Alexa 647 эффективно инициализированы в их темное состояние в буфере изображения может быть фото-активирована с помощью применения 405 нм УФ-излучения. Изображения получены захватывающим редким подмножеством молекул Alexa 647 в плотно маркированную выборку и локализации каждого флюорофора с точностью, ограниченной главным образом количеством собранных фотонов. Эта процедура неоднократно итерируется программным обеспечением до тех пор, пока не произошло желаемое количество циклов приобретения. Экспериментатор должен иметь эту настройку коррелируют с каждым флюорофор в образце были фото-отбеленные.
11. После завершения визуализации выключите оборудование для визуализации в соответствии с указаниями производителя. Программное обеспечение может быть оставлено открытым для анализа данных.
12. Анализ данных в значительной степени зависит от эксперимента; однако во всех случаях идентифицируют вирусы по их полной ширине в два раза меньше, чем по сравнению с известными размерами вируса, убедившись, что они принимают во внимание дополнительный размер флуоресцентных меток.
13. Для лучшей визуализации, просмотреть образцы, используя либо вариант визуализации Isosurface или опцию объемного рендеринга, оба из которых, как правило, находятся в супер-разрешение изображения программного обеспечения.

Результаты

Одновийная визуализация с помощью AFM:

Протокол подготовки образца, изложенный выше, использовался для прикрепления диких виньонов типа к поверхности стекла. VSV virions имеют пулевую форму 180 нм в длину и 80 нм в диаметре. Поскольку существует множество виритов, для которых этот метод может быть применен, концепция также демонстрируется здесь на биотинилированных 36 нм бисера, а также. Полученные эксперименты AFM показаны на рисунке 1. Важно отметить, что VSV virions имеют более низкий модуль Янга (100 MPa) по сравнению с неувелицами вирусами (GPa). Конкретные изображения одного вириона VSV были получены в режиме касания в условиях окружающей среды с жесткой кантилевером. Цель состояла в том, чтобы деформировать вирус до точки, что дополнительная плотность белка в вирусе становится видимым в качестве удара в изображении AFM. Этот метод используется для обнаружения дополнительной плотности белка в вирусной полости^19.

Одновийная визуализация супер разрешения:

Антитела Alexa 647 с маркировкой VSV-G использовались для покрытия оболочки отдельных виньонов VSV для экспериментов с супер-разрешением с использованием метода 5A. Чтобы продемонстрировать плотность привязывания и низкий неспецифический связывание, на рисунке 2A показано большое сканирование образца. Восстановление вирусного конверта на репрезентативном вирионе показано на рисунке 2B (синий изосурфейс).

Рисунок 1. AFM изображения бисера и VSV на функциональной поверхности PEGG. AFM сканирование 36 нм биотинилированных бусин(A, B) и VSV virion(C) закреплены на поверхности с биотинилированным антителом VSVG. AFM был сделан в режиме топографии воздуха переменного тока. Радиус наконечника составляет <25 нм, а измерения проводились под силовой модуляцией и нажатием света. Наконечник имел константу силы 3 Н/м и резонансную частоту 75 кГц с неопределенностью 15 кГц. В то время как бисер сохранил свой рост во время сканирования AFM, VSV virion имеет модулы значительно меньше молодых и значительно деформирован в высоту. На этом изображении вирион был специально изображен с жесткой кантилевер в режиме постукивания, который произвел небольшой xy свертки (используется для определения кончика против тупой конец вируса) и разница в высоте между кончиком и тупым концом вируса используется для обнаружения дополнительной плотности белка на тупом^{конце вируса 19}.

Рисунок 2. Флуоресценция на основе изображения VSV виньоны на функциональной поверхности PEGG. A)рекомбинантные VSV virions обездвижены на поверхности PEGG с помощью биотинилированных анти VSVG антител, изображенных в широком поле флуоресценции. B)Реконструкция флуоресценции высокого разрешения оболочки VSV, прикрепленной к поверхности PEGG через биотинилированные анти VSVG антитела и украшенные Alexa 647 помечены анти-VSVG антитела (Метод 5A был использован для создания этих изображений). Синяя поверхность является 2D проекцией изосурфейса. Слева показана модель вируса в форме пули. 

Размер обложки	жидкость
40 мм	65 хл
35 мм	50 мкл
30 мм	36 хл
25 мм	25 хл
20 мм	16 хл

Таблица 1. Алициты жидкости в соответствии с размером крышки.

Обсуждение

Одновийная визуализация с помощью AFM и флуоресцентной визуализации высокого разрешения может быть использована в качестве альтернативной методологии криоэмографии. Каждая из этих методологий имеет свои специфические сильные стороны. Например AFM можно сделать на WT virions без требования на маркировании образца или внутренне вирусных протеинов. Расположение вирусных структур не связано с их вкладом в эластичные свойства вириона.

Одновирионная визуализация супер-разрешения в сочетании с недавно разработанными вирусными обратными генетическими подходами становится мощным методом локализации низкого числа копий^{вирусных белков 20.} Рекомбинантные вирусы с заменой их белков белками, слитыми с флуоресцентными белками, могут быть сделаны и очищены с помощью этих обратных генетических подходов. Хотя визуализация супер-разрешения имеет специфичность отчасти из-за генетической пометки, она требует использования вирусов-мутантов.

AFM и супер-разрешение изображения являются бесплатные методы, которые используют очень похожие препараты образца. Методы, изложенные в этой статье, которые приняты в виде более ранних анализов одной молекулы изображения, позволяют якорь одного виньоны с небольшим влиянием на топологию виньонов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass coverslips (fPALM)	Electron Microscopy Services	72225-01	25 mm Coverslips
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)	SuSoS	-	Stock: 0.5 mg/ml in PBS
NeutrAvidin biotin-binding protein	Invitrogen	A2666	Stock: 0.25 mg/ml in PBS
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21245	1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer
α-VSV-G	Invitrogen	ab34774	1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer
Gluox	Sigma	G2133-250KU	Glucose oxidase type seven from Aspergillius
Catalase	Sigma	C40-100mg	Catalase from Bovine liver
MEA	Sigma	30070-10G	Cysteamine (MEA
Stock Buffer			50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose
NTE			10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA
Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit	Thermo Scientific		10,000 MW
Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1	Fisherbrand	35 CIRCLE #1