Terapia basada en células de la insuficiencia cardiaca en rata: Doble toracotomía para infarto de miocardio y epicardio implantación de células y Biomatrix

Resumen

Implantación de un biograft para tratar el infarto de miocardio inducido por ligadura de LAD en un modelo de roedor ha requerido convencionalmente dos cirugías a corazón abierto. Con el fin de reducir la mortalidad y proporcionar las condiciones óptimas para la fijación de biomatrices sólidos gelatinosos y asociados con las células, se han desarrollado procedimientos mínimamente invasivos.

Resumen

Terapia celular cardíaca ha ganado cada vez más interés e implantación de biomateriales asociados a células se ha convertido en un problema importante para optimizar la entrega de las células del miocardio. Modelo de roedor de infarto de miocardio (IM) que consiste en arteria descendente anterior izquierda (LAD) ligadura comúnmente se ha realizado a través de una toracotomía; una segunda operación a corazón abierto a través de una esternotomía tradicionalmente se ha realizado para la aplicación epicárdica del tratamiento. Desde la descripción del modelo de la ligadura de LAD, la tasa de mortalidad después de la cirugía se ha reducido desde 35 hasta 13%, sin embargo la segunda cirugía se ha mantenido crítico. Con el fin de mejorar la recuperación después de la cirugía y reducir el dolor y la infección, se presentan procedimientos quirúrgicos mínimamente invasivos. Se realizaron dos toracotomías, la inicial para la ligadura de LAD y la segunda para la administración epicárdica tratamiento. Biografts que consisten en células asociadas con matrices de tipo sólido o de gel se aplica sobre la ar infartadaea. LAD ligadura resultado la pérdida de la función del corazón como se confirmó por ecocardiografía realizada después de 2 y 6 semanas. Tricrómico de Goldner tinción realizó en secciones del corazón confirmó la formación de cicatriz transmural. Primera y segunda cirugías resultaron en menos que 10% de mortalidad post-operatorio.

Introducción

Desde finales del siglo ^19, la enfermedad cardiovascular sigue siendo la principal causa de muerte en serie en los países industrializados. Entre ellos, enfermedad de la arteria coronaria representa la etiología principal. Los resultados de fase aguda en el infarto de miocardio (MI) y es seguido por la remodelación de mala adaptación que se desarrolla progresivamente hacia una fase crónica e insuficiencia cardíaca severa. A pesar de los últimos avances tecnológicos y terapéuticos significativos, la morbilidad y la mortalidad debido a la progresión de la insuficiencia cardiaca sigue creciendo ^1. En este contexto, la terapia celular se ha ganado un creciente interés como una nueva opción terapéutica para detener la progresión de la enfermedad hacia la insuficiencia cardíaca y para estimular la capacidad regenerativa recientemente identificado del miocardio. Las investigaciones experimentales y clínicos han proporcionado evidencia convincente de los efectos beneficiosos obtenidos después de trasplante cardíaco de diversos tipos de células. Resultados principales incluyeron la mejora de cardifunción contráctil ac, disminuyó la remodelación ventricular izquierda, redujo el tamaño del infarto, y el aumento de la densidad vascular en la zona infartada. Sin embargo, la retención de número bajo de células después de la inyección de células se mantuvo un importante inconveniente. Asociación de células con un biomatriz para mejorar la entrega de la celda ² han contribuido a alimentar el investigador y los intereses clínicos.

La ligadura de la arteria descendente anterior coronaria (LAD) es un método de referencia para la MI en modelo animal pequeño que resulta en infarto transmural y una cicatriz madura. La terapia celular aplicada en la fase crónica de MI requiere una segunda intervención quirúrgica. Una esternotomía media se lleva a cabo por lo general para permitir la inyección intramiocárdica de las células o la implantación epicárdica del biografts. Tales procedimientos quirúrgicos invasivos aumentan la tasa de mortalidad, después de la cirugía el tiempo de recuperación, dolor, y el riesgo de infección. El abordaje mínimamente invasivo que aquí se presenta no sólo evita que ese sesgo, sino también proporciona oaccesibilidad ptimal del corazón para la aplicación del tratamiento. MI e implantación epicárdica de células asociadas a un tipo de gel biomatriz se realizan en un corazón que late a través de una toracotomía intercostal izquierdo.

Protocolo

NOTA: Lewis ratas machos y hembras, de 200-220 g fueron alojados en condiciones de laboratorio estándar (12 horas de luz y oscuridad ciclo, agua ad libitum y alimento, IVC jaula). Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las recomendaciones del la Ley suiza FELASA y en materia de protección animal.

1. Cell Preparación: Aislamiento de células madre mesenquimales de la médula ósea

1. Anestesiar las ratas con isoflurano al 5% y O ₂ 5 L / min en una cámara de inducción durante 5 min. Coloque el hocico del animal en un cono de nariz conectado al sistema de anestesia. Realizar un dedo del pie o de la cola pellizcar para confirmar la sedación.
2. Quitar la piel de la pierna con unas tijeras cortando la piel desde el tobillo hasta la cadera. Quitar los músculos y cortar la arteria femoral por desangramiento animal. Exponer la articulación de la cadera y luxación de la cabeza del fémur. Es importante no dañar la cabeza del fémur. Coloque los huesos en PBS estéril en un tubo de plástico de 50 ml.
3. Retire todos los muscles y ligamentos de los huesos sin romperlos. NOTA: Es importante que el hueso se mantiene intacta para evitar la vinculación de la solución de enjuague o contaminación con etanol. Enjuague los huesos pelados en etanol al 70% durante 5 min.
4. Bajo la campana de flujo laminar estéril, cortar en ambos extremos de los huesos con tijeras. Enjuague la médula ósea mediante la inyección de PBS estéril desde el extremo del hueso. Recoger ósea en un tubo de 15 ml. Centrifugar 7 min a 300 x g.
5. Eliminar el sobrenadante. Suspender el sedimento en 3 ml de glóbulos rojos Tampón de lisis. Incubar la suspensión durante 1 min a temperatura ambiente antes de girar de nuevo durante 7 minutos a 300 x g. En un frasco de cultivo de 150 ml, añadir medio de cultivo celular estéril (395 ml de medio IMDM, 5 ml penicilina / estreptomicina, 100 ml de FBS) y sembrar las células.
6. Cambie medio del segundo día para eliminar las células no adherentes.
   1. Realizar cambios de medio cada dos días durante 2-3 semanas, hasta que se obtiene la cantidad de células deseada.
   2. Por otra parte, preparar el biograft por semillaing las células sobre la matriz sólida según sea necesario y descrito en otra parte ^3.
7. El día de la implantación cardiaca, preparar las células o cosechar el biograft justo antes de la aplicación del epicardio.
   1. Recoger las células por medio de solución de desprendimiento celular Accutase. Contar las células. Llenar un tubo de centrífuga de 1,5 ml con el volumen de suspensión celular calculada de obtener una cantidad de células deseado. Centrifugar durante 7 min a 300 xg y eliminar el sobrenadante.
   2. Como alternativa, recoger el biograft del medio de cultivo celular, se lava en PBS estéril, y mantenerse en medio de cultivo fresco sin suero.

2. Primera toracotomía y LAD Ligadura

1. Pese la rata. Encienda la almohadilla térmica a 37 ° C. Anestesiar la rata con 5% de isoflurano y 5 L / min 100% de O ₂ en una cámara de inducción de 5-7 min. Realizar un dedo del pie o de la cola pellizcar para confirmar la sedación. Coloque la rata sobre el cojín eléctrico.
2. Intubar al animal con un 14T catéter iv. Conectar el catéter de intubación a un ventilador de roedores programado para 2,5 L / min de oxígeno, 2,5% de isoflurano, volumen corriente de 2 ml, y una frecuencia de respiración de 90 respiraciones / min.
3. Preparar una solución de buprenorfina a 0,1 mg / kg. Inyectar por vía subcutánea un tercio de la solución. Afeitarse la parte izquierda del tórax. Desinfectar con una solución de Betadine 1%.
4. Incisión en la piel perpendicular al esternón en el cuarto espacio intercostal. Separe las 3 capas de músculo torácico (pectoral mayor, ascendiendo pectoral y pectoral oblicuo externo). Abra el cuarto espacio intercostal (entre las costillas 4 y 5).
5. Utilice un pequeño retractor para separar las costillas y para exponer el corazón. Abra el pericardio cuidadosamente. Busque y ligar la arteria descendente anterior coronaria (LAD) con un 7,0 sutura 4 mm por debajo del atrio.
6. Cerrar el espacio intercostal con dos puntos de sutura utilizando 3,0 suturas. Coloque los dos suturas proximal y distalmente desde el esternón. En primer lugar, tighten la sutura distal. Cierre la tubería de escape del ventilador durante 2 segundos con el fin de inflar el pecho y evitar cualquier neumotórax. Apriete la segunda sutura. Coloque las capas de músculos en su lugar (no se necesitan puntos de sutura). Cierre la piel con una sutura de 5,0.
7. Desinfectar la sutura con una solución de Betadine 1%. Inyectar el resto de la solución de buprenorfina. Apague el sistema de anestesia. Retire el catéter de intubación.
8. Mantenga la rata en la jaula bajo una lámpara caliente durante 1-2 horas. Mantenga un termómetro en la jaula y controlar la distancia entre la lámpara caliente y la jaula con el fin de evitar el exceso de calentamiento. Volver a la rata en la unidad IVC. Inyectar por vía subcutánea Buprenorfina 0,05-0,1 mg / kg mensaje -operatively cada 6-12 h durante 48 h.

3. Administración epicárdica de la Vía Tratamiento Segundo toracotomía

1. Repita los pasos 2.1 a 2.3.
2. Incisión en la piel perpendicular al esternón en el quinto espacio intercostal. Se separa la capa 3s de los músculos torácicos (pectoral mayor, ascendiendo pectoral y pectoral oblicuo externo). Abra el quinto espacio intercostal (entre las costillas 5 y 6).
3. Utilice un pequeño retractor para separar las costillas y para exponer el corazón. Si hay alguna adherencia, retire con cuidado con unas pinzas finas.
4. Localizar el área de infarto que aparece como un área pálido por debajo de la ligadura. NOTA: Cuando sea necesario, utilice un trozo de 10 cm de sutura (7.0) que se inserta en el ápice para visualizar mejor el ventrículo izquierdo. Tire suavemente a la sutura mantenido ligeramente por una abrazadera para exponer el corazón.
5. Aplicar uno de los siguientes tratamientos:
   1. Coloque el biograft en la superficie del corazón. Utilice la jeringa precargada sellador de fibrina precalentado a temperatura ambiente durante 10 min. Aplique una gota (50-100 l) de sellador de fibrina en el biograft utilizando una aguja de 25 G Luer. Verifique que el biograft está perfectamente sellada.
   2. Por otra parte, aplicar el sedimento de células recogido con una punta de pipeta en la superficie of el corazón en el área de pálido por debajo de la ligadura. Aplicar una gota (50-100 l) del sellador de fibrina en el sedimento celular.
6. Retire el trozo de sutura desde el vértice.
7. Repita los pasos 2.6 a 2.8.

Resultados

Todos los animales se recuperaron dentro de 1 hora después de una toracotomía. La cicatrización de la herida fue rápida. No se observó ninguna infección o edema.

El doble toracotomía izquierda permitió un acceso óptimo al corazón (Figura 1). El dolor y la mortalidad después de la cirugía fueron bajos. El animal se recuperó rápidamente de la cirugía y aumentaron de peso (Figura 2). Kaplan Meir porcentaje de supervivencia fue del 96% para la pri...

Discusión

La ligadura permanente de LAD causa daño irreversible del miocardio. El primer modelo animal fue descrito en 1960 ^4. Desde entonces, se ha considerado como un modelo estándar y adecuado para MI crónica. Su estabilidad y reproducibilidad permite la evaluación experimental de las terapias para el MI ^5. Mejora de los procedimientos posteriores a la descripción inicial reportaron una tasa de mortalidad operatoria del 35-13% ^6.

Como era de esperar, la ligadur...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polysorb 3-0 suture	Covidien	UL 204
Polysorb 5-0 suture	Covidien	UL 202
Surgipro II 7-0 Suture	Covidien	VP904X
Catheter Insyte 14 G	BD	381267
Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator	Harvard Apparatus	557058
Dumont #7 Forceps	FST Germany	11274-20
Fibrin Sealant	Baxter	1501441	TISSEEL Glue, Frozen -20 °C
Castroviejo Eye Specula	Harvard Apparatus	72-8925	use as retractor for the ribs
IMDM GlutaMAX	Gibco	31980
Pen/Strep	Gibco	15140
FBS	PAA Clone	A15-101
Bone Scissors	Fine Science Tools	16044-10
Red Blood Cell Lysis Solution	Gentra Systems	D-50k1
Accutase Cell Detachment Solution	Stem Cell Technology	7920